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1Biacore检测Fcɣn效应分子和IgG相互作用的操作方法2目录一、实验目的：...........................................................................................................................................3二、实验试剂和耗材...................................................................................................................................3三、实验步骤..............................................................................................................................................4（一）、仪器准备...................................................................................................................................4（二）、样品稀释...................................................................................................................................8（三）、样品检测过程...........................................................................................................................8（四）、实验结果分析.........................................................................................................................223BiacoreT200检测Fcɣn效应分子与IgG结合操作指南一、实验目的：利用Biacore检测Fcɣn效应分子与IgG结合的动力学数据Ka、Kd及亲和力数据KD。抗原Fcɣn分子量为43.5KD，商业化蛋白带有His标签；IgG分子量为150KD。本实验利用NTA芯片捕获Fcɣn，IgG分子作为分析物检测Fcɣn与IgG结合的动力学数据和亲和力数据。二、实验使用机型、试剂和耗材1、本实验所用的机型为：BiacoreT200。2、S系列NTA芯片及试剂盒（试剂盒内含有0.5mMNicl2溶液和350mMEDTA）。S系列NTA芯片货号：BR-1004-07（一片装），BR-1000-34（三片装）；NTA试剂盒货号：28-9950-43。购买地均为GEHealthcare。3、缓冲液：10×pBS-P+pH7.4（货号：28-9950-84）；购买地为GEHealthcare。4、去离子水（用0.22uM膜过滤过）。5、配体Fcɣn：如果为商业化蛋白粉末，用水稀释到100ug/ml或200ug/ml，分装在-20℃保存。推荐使用：Sinobio，无论使用哪家的Fcɣn，客户需要确定Fcɣn的活性，在进行溶解时，确保溶解液中不含Tris。6、IgG：母液IgG浓度至少在1.5mg/ml，样品体积在200ul以上纯度90%以上（即跑SDS-PAGE胶有两条带）。如果IgG中的盐离子浓度或多糖浓度过高可进行脱盐，如果体积小于500ul选择GEHealthcare的PDMiniTrapTMG-25，货号为28918007；如果体积小于1ml选择货号为28918008的GEHealthcare的PDMiniTrapTMG-25；如果体积在1.75-2.5mL选择GEHealthcare的PD-10Deasalting，货号为17085101。46、其他耗材：无盖1.5mlEP管（货号：BR-1002-87）、96孔板（货号：BR-1005-03）、2型橡胶盖（货号：BR-1004-11）、96孔板封口膜（货号：28-9758-16），购买地均为GEHealthcare。三、实验步骤（一）、仪器准备1、开机操作1)打开BiacoreT200系统和电脑的电源开关。BiacoreT200的电源开关位于系统背面的左下角。开机后，需等待检测单元的温度达到预设温度（用户自设，通常为25℃）。待温度稳定后，面板上的温度指示灯（黄色）会停止闪烁，该过程可能需要30-60分钟。2)打开BiacoreT200控制软件（Strart→Program→Biacore→BiacoreT200ControlSoftware），运行后软件程序会自动和主机系统建立连接。3)准备运行缓冲液。已经0.22μm膜过滤）：量取50ml10XHBS-EP+缓冲液、450ml去离子水，混匀后放入500ml缓冲液瓶。2、缓冲液的放置1)将已经配制好的缓冲液放在T200系统左侧的缓冲液托架上，换上黑色的单孔盖。2)将缓冲液进液管A（注意软管上的蓝色标签）插入至缓冲液瓶底部。其余三根进液管（B、C和D）放在左侧的舱门后。3)将2L的废液瓶放置在T200系统右侧的缓冲液托架上，连接上专用的盖子。4)取500ml去离子水装入500ml缓冲液瓶，放置在右侧缓冲液托架上，并将进液管A插至瓶底。瓶中的水将用于清洗进样针。3、芯片的放置1)点击工具条中的按钮或选择Tools菜单中的InsertChip选项，打开芯片舱门。2)如果已经有芯片在芯片舱内，点击工具条中的按钮或选择Tools菜单中的EjectChip选项。5点击EjectChip，流动池中的液体将被排空，随后芯片舱门将自动打开。3)如果使用的是新芯片，选择NewChip。在ChipType的下拉菜单中选择对应的芯片种类（此实验为NTA芯片），在ChipId中填入和芯片相关的实验信息，ChiplotNo.中可填入芯片批号（选填）。如果是已经使用过的芯片，请选择ReuseChip，并在ChipId下拉菜单中找到与之相对应的芯片信息。4)手持芯片，有字的一面朝上。按照芯片上的箭头方向，将芯片轻轻推入卡槽，最后合上芯片舱的舱门。芯片的放置方法5)点击DockChip按钮，芯片置入后系统将自动转入待机（Standby）状态。6)选择Tools→Prime命令，点击Start。缓冲液会以较高的流速冲洗整个内部的流路系统，整个过程耗时6-7分钟。结束后，点击Close，系统自动转入待6机（Standby）状态。注意：当系统更换缓冲液或者芯片后，必须运行Prime程序。Prime时缓冲液会冲洗整个流路系统，为下一步的实验做好准备。4、放置试管架1)BiacoreT200有三种不同的试管架供用户使用：ReagentRack1、ReagengRack2（图A）和SampleandReagentRack1（图B），见下图。图A：ReagentRack1&2（左1右2）图B:SampleandReagentRack1ReagentRack1&2通常和96/384微孔板配合使用，加装在指定的试管架底座上。具体的组装方式参见下图。ReagentRack1&2和96/384微孔板安装方式本次实验中，主要使用ReagentRack1和96微孔板配合使用。2)点击工具栏按钮，或选择Tool→EjectRack，样品舱舱门会自动打开。注意：试管架的弹出功能按钮在“程序向导设置”和“手动运行模式”中会有特定的位置，请注意区别。具体操作会在后文中说明。3)用手指将试管架下方的金属按键向里侧按（见下图中白色箭头），试管架将会解除锁定并弹出，然后可以轻轻抽出试管架。7试管架的取出方式4)按住试管架右侧的黑色按钮，向左侧打开金属盖。放入相应的试管后，轻轻合上金属盖。听到“咔”声，表明金属盖已经处于锁定状态。5)将试管架沿着卡槽轻轻推入样品舱，听到“咔”声，表明试管架已经处于正确位置并锁定。试管架的放入方式6)点击EjectRackTray对话框中的OK，试管架会被自动送入样品舱，舱门也会自动合上。注意：样品舱舱门打开后会有时间限制，打开60秒后舱门将自动合上。最后15秒时，对话框中的倒数计时会显示为红色字体并闪烁。此时请不要强行将试管架放入，以免夹到手。可以等待舱门合上后，重新打开即可。8（二）、样品稀释1、运行缓冲液：如果缓冲液用的是10×pBS-P+pH7.4稀释为1×pBS-P+并将PH调到6.0，至少配置200ml的运行缓冲液。根据实验不同调整缓冲液的配置量。2、配体Fcɣn浓度：用运行缓冲液将配体溶液稀释至0.5ug/ml，800ul。3、IgG浓度：实验中用运行缓冲液将IgG浓度分别稀释为：3.0uM,1.5uM,0.75uM,0.325uM,0.165uM,0uM。（三）、样品检测过程本实验为多循环检测1、配体偶联量的调试1)打开BiacoreT200ControlSoftware,点击Run下面的ManualRun。在ManualRun对话框中在Flowrate（流速）中输入10μl/min。除动力学测定实验外，流速一般设为10μl/min。在Flowpath中选择Flowpath2。在Rack栏选择Rack1，接着按Start。92)在saveResultAs对话框中，创建新的目录并命名保存。3)准备3个1.5mlEP管，分别装有500ul的Nicl2，300ul0.5ug/ml的Fcɣn蛋白，500ul350mM的EDTA。如果使用的是带盖的EP管，所有盖子必须剪去。4)点击图标（Ejectracktray），退出试管架。将500ul的Nicl2的EP管放在R1D1位置，300ul0.5ug/ml的Fcɣn蛋白放在R1D2，500ul350mM的EDTA放在R1D3。最后将试管架放回样品舱，关上舱门。5)点击注射命令图标（Sampleinjection，红色）。选择Vial/wellposition旁的下拉菜单，在样品位置图中点击R1D1位置。设定Contacttime（进样时间）为30秒，这一步为Nicl2进样。再次点击注射命令图标，选择Vial/wellposition旁的下拉菜单，在样品位置图中点击R1D2位置，设定Contacttime（进样时间）为120秒，这一步为Fcɣn蛋白进样。注意对话框底部显示的是需要的最小样品体积，确认试管中的样品体积满足要求后点击OK。6)点击再生命令图标（Regenerationinjection，蓝色）。Vial/wellposition选择R1D3位置，进样时间为30秒。点击OK。7)点击工具栏图标（快捷方式F8）或选择View→Referenceline，传感图中出现黑色十字坐标以及Referenceline窗口。用鼠标左键选中十字的Y轴，可以对十字坐标进行左右拖曳，而十字的交叉点会在信号曲线上进行运动。十字中心点的坐标将会显示在Referenceline窗口中，以s为单位的是X轴读数，以Ru为单位的是Y轴读数。可用第二次进样结束后的Ru值减去第二次进样前的Ru值为Fcɣn蛋白的上样量，大约为200RU，或者在数据读取栏中第二次Stability的Ru读值为200Ru。如果超出200Ru过多（150%）则减少Fcɣn上样时间或降低Fcɣn的浓度。如果低于200Ru过多（60%）则增加Fcɣn的上样时间或增加10Fcɣn的浓度。以此处的时间和浓度为标准设置后续步骤6中的配体上样时间和浓度。8)所有命令都完成后，点击结束命令图标（Stoprun），退出手动运行模式。2、在打开的BiacoreT200