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ROS荧光探针－二氢乙啶(Dihydroethidium,DHE)，可自由透过活细胞膜进入细胞内，并被细胞内的ROS氧化，形成氧化乙啶；氧化乙啶可掺入染色体DNA中，产生红色荧光。根据活细胞中红色荧光的产生，可以判断细胞ROS含量的多少和变化。二氢乙啶在细胞内主要被超氧阴离子型ROS氧化，用流式细胞仪或荧光显微镜可直接观察，是一种快速简便的组织或培养活细胞中ROS检测方法。染色方法：1)探针溶液可在新鲜培养液、缓冲盐溶液或组织灌流液中稀释到所需浓度，以此染色液更换细胞培养液或灌流液；也可直接向细胞孵育液体或灌流液中加入探针溶液至所需浓度。2)依据细胞ROS含量的不同，二氢乙啶终浓度可选择在1μM~100μM的范围，孵育时间可选择10~90min。孵育可在37℃或室温进行，要求避光。3)孵育结束后，用新鲜溶液清洗细胞或组织。荧光显微照相操作方法：1)对贴壁生长细胞或活组织，可直接在荧光显微镜下观察；对悬浮生长细胞，取25-50μl细胞悬液滴到一张显微载玻片上，再盖上一张盖玻片。2)荧光显微镜下，用蓝光或绿光激发，观察和拍摄细胞红色发射图像，ROS阳性细胞在整个核区被染成红色；用紫外光激发时，胞浆中未氧化的二氢乙啶可发出蓝色荧光。流式细胞分析操作方法：1)对贴壁生长细胞，用胰酶消化制备成单细胞悬液；对悬浮生长细胞，直接收集细胞。用0.5~1ml冰冷PBS重悬细胞（5~10万）。2)采用480~535nm波长激发，测定590nm~610nm以上的发射，细胞应可分成两个亚群：ROS阴性细胞仅有很低的荧光强度，ROS阳性细胞有较强的红色荧光。另外需要注意的是：1)二氢乙啶在光照和空气中易被氧化，注意避光保存。2)该试剂可用于体外培养活细胞、培养或灌流组织及组织冰冻切片的检测。3)对不同的细胞和组织，应选择合适的孵育时间和浓度，以观察ROS的变化。DHEStainingAfterharvest,hearttissueswereimmediatelyembeddedinanoptimumcuttingtemperature(OCT)compoundinethanol–dryiceandstoredat--80,unfixedfrozensampleswerecutinto5um-thicksectionsandplacedonglassslides.DHE(10mol/L)wasappliedtoeachtissuesection,andthenthesectionswerecoverslipped.Theslideswereincubatedinalight-protectedhumidifiedchamberat37°Cfor30min.Ethidiumfluorescence(excitationat490nm,emissionat610nm)wasexaminedbyfluorescencemicroscopy.