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HRM建议标准优化流程LC480甲基化处理•亚硫酸钠处理强度受很多因素影响，且伴随DNA片段化，因此对样品量操作时间等诸多操作细节有严格限制•建议采用商品化试剂盒进行甲基化处理与后续纯化•例如Qiagen的kit提供DNA保护缓冲液，显著降低了对样品量与操作时间的苛刻限制•样品处理后建议再测一次OD值，HRM的样品浓度值不宜太低HRM的PCR扩增基本要求•要求Hotstart，最好5min以上HRM往往是大批量样品，PCR加样时间较长Hotstart可以避免长时间加样导致的非特异性PCR扩增问题•饱和荧光染料，最好耐受光淬灭•快速PCR试剂不适合HRM的PCR要求taq酶的PCR扩增性能和保真性能很难同时保证HRM本质是检测突变，因此要尽量避免在PCR扩增过程中引入突变LC480HRMMasterMix20/10/5ul反应体系灵敏度15%•20/10ul杂合•5ul杂合LC480HRMMasterMix•10ul或20ul体系都可以，所有体系按比例配制即可•如下20微升体系HRMmix10ulMg离子2.4ul引物F0.2ul引物R0.2ulDNA10ng补水到20ul10微升体系HRMmix5ulMg离子1.2ul引物F0.1ul引物R0.1ulDNA5ng补水到10ulLC480HRMMasterMix10ul体系•注意该处调为10TouchdownPCR/触底PCR•突变或甲基化检测很难设计理想的引物•免于实验条件的摸索优化•避免引物二聚体与非特异性扩增的出现•设计引物预期Tm+3度作为起始退火温度，每个循环降低0.5或1度，直至53度TouchdownPCR/触底PCR循环数增加到50~55cycles（触底PCR及低引物浓度共同决定）TouchdownPCR/触底PCR工作原理•高退火温度时，PCR扩增的特异性好，但效率低•低退火温度时，PCR扩增的效率高，但特异性低•前面几个循环先保证PCR扩增特异性，优先合成较多特异性PCR产物•后面的循环由于特异性模板增多，降低退火温度也有较好特异性•后面几十循环低退火温度，确保高扩增效果低引物浓度推荐0.2uM，建议0.1~0.3uM•低引物浓度，避免引物二聚体与非特异性扩增•对Mg++浓度等因素的抗干扰能力更强•PCR扩增需要更多循环数，建议50~55cycles低引物浓度高、低引物浓度条件下的熔解曲线比较•16号DNA0.5ul引物0.2ul引物优化Mg++浓度推荐终浓度3.0mM，即20ul体系加2.4ul•优化Mg++浓度的模板选择建议选择来自不同方法、批次及质量的模板DNA•推荐选择优化浓度•评价标准：引物二聚体、非特异性扩增、Ct值与扩增曲线形状HRM的PCR扩增•注意左右2个图中扩增曲线的纵坐标因触底PCR及引物低浓度，不会有明显平台期HRM的PCR扩增•因触底PCR及引物低浓度，不会有明显平台期HRMMastermixSybrGreenmix绝大多数实验甲基化HRMLightCycler480HRM解决方案•起始条件：LC480HRMmastermix+触底PCR+低引物浓度0.2uM或40%正常引物浓度（常规退火温度+3度为起始退火温度，降到53度）优化Mg++浓度•批量HRM筛查10微升体系:HRMmix5ulMg离子1.2ul引物F0.2uM引物R0.2uMDNA2.5~5ng补水到10ul0-样品纯化后稀释到适当浓度掺入野生型样品（1/7)极少数SNP或PCR500bp大批量分子生物学试验的细节•96孔板或八联管存放样品，便于排枪操作•样品进行适当稀释，减少加样误差•Ranin排枪的平行性最佳•注意样品/枪头的摆放位置与秩序甲基化HRM主要问题及解决•亚硫酸钠处理后得率低商品化亚硫酸钠处理及纯化试剂盒避免对样品量与操作的严格要求•PCR难以扩增出来原装LC480HRM试剂盒+Mg优化+触底PCR•引物设计也有一定影响可设计2-3对引物，并考虑交叉配对甲基化PCR优化技巧•在引物中引入甲基化位点倾向性扩增甲基化或非甲基化序列，适当提高对甲基化或非甲基化含量的分辨率例如常规条件可检出1%的甲基化，重新设计的引物倾向扩增甲基化序列，那么可检出比例更低至0.1%的甲基化•ColdPCRPCR循环中变性步骤中降低变性温度，使高CG含量的双链DNA分子更少解链从而抑制退火步骤中引物与高CG含量的双链DNA分子的结合进而抑制延伸步骤taq酶对高CG含量的PCR单链DNA分子扩增倾向性扩增低CG含量的模板，检测更低比例的非甲基化480数据分析•避开二聚体•某些突变分不开？与qiagen的区别•Qiagen耗材•实验程序•软件功能•PCR扩增•巢式PCR后HRMWeInnovateHealthcare