细胞培养原理和基本技术

细胞培养原理和基本技术•细胞全能性•细胞培养是基于细胞全能性发展起来的细胞生物学技术•克隆：无性繁殖•植物细胞培养---转基因植物•动物细胞培养---转基因动物扦插生根发芽成为植株培养植物克隆丰富了人民的生活植物克隆丰富了人民的生活转基因植物•将外源目的基因转入植物的细胞、组织、器官中，获得更能满足人民生活的需要的植物。细胞、组织、器官外源目的基因克隆根、茎、叶、花、果实、种子、植株抗蚜虫小麦抗旱耐盐碱水稻；富含铁的水稻；富含β胡萝卜素水稻抗除草剂作物转基因棉花：动物角蛋白(免、羊毛)棉花，光泽好，手感好，保暖性增强。既保留了传统棉花的天然本质，又具有了免、羊毛的某些品质；彩色棉花棕、绿、黄、浅蓝、粉红、浅褐等；抗虫棉转基因大豆更富营养、耐贮藏番茄；不含尼古丁烟叶、能产生药物的食品动物细胞培养技术一基本概念•从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存和生长并维持其结构和功能的技术•原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外条件下生长称为原代培养。•原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。采用原代培养细胞进行药物测试、细胞分化等，效果较好•原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致•传代培养：细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中•原代培养物经首次传代成功后的细胞即为细胞系(cellline)•从一个经过生物学鉴定的细胞系由单细胞分离培养或通过筛选的方法由单细胞增殖形成的细胞群称细胞株(cellstrain)二体内、外细胞的差异•体内细胞：机体神经体液调节和其他类型细胞影响基因表达受到外来信号调节增殖过程中不断发生着分化（由一般到特殊）高度特化的结构和功能•体外细胞：失去机体神经体液调节和其他类型细胞影响细胞的许多外来信号被切断特定分化基因表达减弱或停止而进化中保守的增殖活动维持（由特殊到一般）与体内细胞结构和功能的差异特征：失去原有形态，分化特性减弱形态和功能趋于单一一定代数后衰老死亡，或发生转化，获不死性而成为能无限传代三培养细胞的类型及其特点•1.贴附型贴附于支持物表面，生长中形成汇片。大多数细胞属此型。失去在体内特有形态。–成纤维细胞型、上皮细胞型、游走型、多形型2.悬浮型悬浮生长，单个分散或成团。各种源自血液的细胞、骨髓、脾细胞。•HEK293（左）和小鼠成纤维细胞（右）四培养细胞的生存条件•培养细胞所需营养物质•基本营养：与体内相同，包括糖、氨基酸、无机离子、维生素、微量元素（1640，F10，F12，DMEM等等）•生长因子：动物血清（小牛血清，胎牛血清）•基本培养液（80～90％）血清（10～20％）•抗生素：双抗（青霉素-链霉素）终浓度为每毫升100单位•特殊条件：高糖、胰岛素、PHA……根据自己实验特殊需要•培养环境•温度：35~37℃•湿度：恒湿•气体：95%空气/5%CO2，N2•酸碱度：pH7.2~7.4（酚红指示）•渗透压：=血浆渗透压290Osm/kg•支持物：玻璃、塑料、饲养层、微载体五每代贴附生长细胞的生长过程•游离期：细胞接种培养后，在培养液中呈悬浮状态。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形•贴壁期：细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，游离期结束。初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10～30分钟即可贴附•潜伏期：细胞贴附于支持物后，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。细胞潜伏期与细胞接种密度、细胞种类和培养基性质等密切相关。原代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。对数生长期•指数增生期：这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。此时培养液消耗大，细胞代谢旺盛。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，是进行各种实验最好的和最主要的阶段。细胞冷冻和细胞转染应该在此时进行。•接触抑制：随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（ContactInhibition）。恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。•停滞期：细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平顶期•进入停滞期的细胞应该及时传代。•细胞代谢活动使培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低，若继续培养，细胞易发生形态改变，甚至死亡。故应及时传代•虽进行了传代，但传代过晚会影响下一代细胞的机能状态。这是在实验中应特别注意的•超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸•CO2培养箱•倒置显微镜•酶标仪、微孔板震荡器•液氮罐•自动双重纯水蒸馏器，纯水仪•耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管实验用品：CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2。使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气保持培养箱内空气干净箱内用无菌蒸馏水保持箱内湿度不宜长时间将门打开器械和手的消毒纯水仪六原代细胞培养的步骤•1．取材：注意无菌，尽量选择低分化组织。小鼠肺，实体瘤，血液•2．切割：用灭菌的PBS液清洗，用眼科手术剪反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，用PBS清洗到组织块发白为止•3．消化：0.25％胰蛋白酶—0.02％EDTA混合消化，37℃（8～10min)•4．接种培养：加入5～10ml含5％小牛血清的培养基，用吸管吹打混匀，移入培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养•5．观察•传代培养：指数期细胞，BPS清洗，0.25％胰蛋白酶消化，BPS清洗，置入新的培养瓶，培养•传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次•传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代•传代次数与组织的分化程度有关•细胞培养程序简单，操作要注意•1.全程防止污染•2.尽量用商品培养基，用优质血清，用同一批号血清•3.培养器皿尽量用商品化的，且不宜反复用•4.分化程度高的组织不容易培养•5.培养条件（温度/气体），培养箱的温度指示是否准确•其它•血清质量好坏是实验成败的关键•常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好•优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染•血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟。有的公司血清已经灭活•现在的商品血清都已经是无菌的，不需要再灭菌七细胞冻存和复苏•细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化•冻存和复苏的原则：慢冻快融•当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶•如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反．结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶低温保护剂的应用•在细胞冻存时加入低温保护剂，能大大提高冻存效果。•常用的低温保护剂是DMSO和甘油，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤＃冻存要慢，复苏要快细胞冻存方法•预先配制冻存液：含20%血清培养基10%DMSO•细胞准备：选用对数生长期细胞---在收集细胞24h前换液一次---用常规方法将细胞消化下来---悬浮于含10％DMSO的培养液中。冻存的细胞数量要充分，因复苏时接种的细胞数量应比平时多一些•冻存：细胞程序冷冻仪，能精确地控制冷冻速度•在没有程序冷冻仪时，可用手工方法。从把冻存管悬在液氮容器口开始，在30～40min时间内，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中•注意标记细胞名称和冷冻日期细胞复苏方法•（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～~38℃水浴中，使其融化（1分钟内）•（2）5分钟内用预热培养液稀释至原体积的10倍以上•（3）低速离心10分钟•（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞•DMSO在常温下对细胞有毒，应在细胞复苏后尽量和尽快除去