细胞培养室的设计

细胞培养室的设计教学目标了解动物细胞培养室的区域划分原则熟悉动物细胞培养室各区域的主要功能掌握动物细胞分离培养的工作要求掌握动物细胞培养室的规章制度本次课主要内容一、细胞培养室的设计二、细胞培养室的功能分区三、动物细胞培养室的规章制度动物细胞培养室的实验对象是离体的组织和细胞，对致病微生物及病毒无抵抗力，有被污染的危险，因此，细胞培养室不同于其他实验室之处就是要保持无菌。般来说，无菌条件并不是要花很多钱去创造一个很大的无菌区域，重要的是动物细胞培养室能够防尘和不设立通道。使用超净工作台是创造无菌条件的简便方法，能为局部提供无菌条件，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。动物细胞培养实验室应具备进行无菌操作、培养、准备、清洗、消毒灭菌和储存等六方面的功能。各个操作区域最好分别设置于相连的各个房间，特别是无菌操作室最好能单独设置；如果各部门都安置在一个大实验室内，无菌操作区与清洗、消毒灭菌区应分别位于两端，而准备、储存和培养区位于此两区之间。动物细胞培养室的各种工作区域具有不同的特性和用途，在进行相应的操作时，要严格遵守各区域的操作要求和规章制度。本项目主要介绍动物细胞培养室的规划和布局设置、各操作区域的功能、基本设施、设置要求、操作要求和注意事项。细胞培养室第一节动物细胞培养室的设计一、动物细胞培养室的规划动物细胞培养是一种无菌技术，要求工作环境和条件必须保证无微生物和不受其他有害因素的影响。为防止微生物污染和有害因素的影响，动物细胞培养室要求环境清洁，空气清新、干燥、无尘。动物细胞培养实验室由准备区、清洗区、消毒灭菌区、无菌操作区、培养区和储存区6部分组成，这些区域的共同特点是房间要宽敞、明亮，地面要便于清洁、防滑，墙壁的质地光滑坚硬，仪器设备布局合理，方便操作，避免交叉干扰，陈设简洁，便于清扫。1、洁净度和粉尘洁净度是指洁净空气中空气含尘(包括微生物)量多少的程度。粉尘是指悬浮在空气中的固体微粒，习惯上称尘、灰尘、尘埃、烟尘、粉末等。国际标准化组织规定，粒径小于75μm的固体悬浮物定义为粉尘。空气洁净度等级是洁净空间单位体积空气中，以大于或等于被考虑粒径的粒子最大浓度限值进行划分的等级标准，国家药品监督管理局发布的“中国标准”明确规定了洁净度的4个等级(表2．1)。洁净度等级应在空态、静态和动态方法进行测试，使用尘埃粒子测试仪来测定。无菌无毒的操作环境和培养环境是保证细胞在体外培养成功的首要条件。细胞培养对无菌环境要求很高，在细胞操作时，一般需要在100级空气质量条件下进行。在体外培养的细胞由于缺乏对微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物质污染，或者自身代谢物质积累，可导致细胞中毒死亡。2、温度和湿度体外培养的细胞和体内细胞一样，需要在恒定的温度下生存，一般最适宜生长温度为37℃，温度变化不应超过±0．5℃，这主要是由酶和蛋白质所需的最适温度决定的。温度过低时细胞生长缓慢甚至不生长，温度过高导致细胞死亡，温度升高2℃时，则不利于细胞生存，温度达到40℃以上细胞将很快死亡。湿度是表示大气干燥程度的物理量。空气的干湿程度称为“湿度”。在一定温度下，一定体积的空气中含有的水气越少，则空气越干燥；水气越多，则空气越潮湿。在此意义下，常用绝对湿度、相对湿度、比较湿度、混合比、饱和差以及露点等物理量来表示；若表示在湿蒸气中水蒸汽的质量占蒸气总质量(体积)的百分比，则称之为蒸气的湿度。湿度不够或过高都不利于细胞生长。二、动物细胞培养室的功能分区动物细胞培养实验室应具备进行无菌操作、培养、准备、清洗、消毒灭菌和储存6个方面的功能。动物细胞培养实验室的6个区域最好都单独设置，分别置于相连的各个房间，特别是无菌操作室最好能单独设置；如果没有条件，可以将这些区域都安置在一个大实验室内，设计原则一般是无菌操作区与清洗、消毒灭菌区分别位于两端，无菌操作区设在室内较少走动的内侧，而准备、储存和培养区位于此两区之间，仪器设备安装排列合理，便于清洁。1、无菌操作区无菌操作区是只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。在一般环境的空气中，由于存在许多尘埃和杂菌，较易造成污染。因此，接种工作要在空气经过灭菌的环境里进行，小规模的无菌环境可利用超净工作台创造，大规模的需建无菌室。无菌室主要用于实验材料的接种操作，所以也称接种室。理想的无菌室应有内、外两间，内间是无菌操作间，外间是缓冲间。房间容积不宜过大，以便于空气灭菌。缓冲间用于准备工作，还有防止污染的作用，以保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱以及必需的小型仪器。无菌操作间则专用于无菌操作、细胞培养，其大小要适当，且其顶部不宜过高以保证紫外线的灭菌效果；内壁应当用塑钢板或瓷砖装修，墙壁光滑无死角以便清洗和消毒。无菌操作间容积小且为密闭式，一般无菌操作间的空气消毒用紫外线灯，有的实验室使用无臭氧紫外线消毒器或电子消毒灭菌器。无菌室内间当设拉门，以减少空气的波动，拉门应设在离工作台最远的位置上；外间的门最好也用拉门，且应与内间的门错开，要设在距内间最远的位置上，两个门也不要同时开启，以保证无菌室不因开门和人的进出带进杂菌；缓冲间内应该设有水槽、鞋帽架、柜子和紫外灯，备有消毒服装、鞋、帽、口罩、盆、手持喷雾器等。内间应配有工作台、紫外灯、解剖镜、各种接种器械等，工作人员进入操作间要穿上消过毒的工作服和拖鞋。在条件比较简单的实验室，要进行组织细胞培养实验，可以采用自制的单人或双人无菌操作箱。箱内可安装紫外线灯供消毒灭菌和日光灯供照明，操作时仅双手伸入箱内，也可达到一定的无菌条件。由于箱内空气不流动，温度较高，因此操作时间不宜太长，仅可做一般的细胞培养工作。无菌操作区的常用的设备和用具有1—2台超净工作台，配有酒精灯、镊子、剪刀、不锈钢的器具、75％的酒精棉球、特种蜡笔、铅笔、记录本、标签纸、废物筐等。无菌室容积小而严密，使用一段时间后，室内温度很高，故应设置通气窗。2、培养区培养区为组织细胞提供适宜温度进行培养：培养区对无菌的要求不像无菌区那样严格，但仍需清洁、无尘，因此也应设在干扰少而非来往穿行的区域。小规模的培养在恒温培养箱中进行，大规模的培养需在可控制温度的培养室中进行。为了控制培养温度，培养室最好设在阳光不能直接照射的地方，一般用拉门，以防止空气流动，并留一个通气窗，安上排气扇，室内温度由空调控制。天花板和内墙最好用塑料钢板装修，地面用水磨石或瓷砖铺设，要光滑无死角，以便于清洁和消毒，也不易在墙角堆积灰尘。培养室外应有一预备间或走廊。建培养室成本费用较高，一般实验室多采用恒温培养箱进行培养：培养区应配有摇床、生化培养箱、CO2培养箱等。3、储存区储存区用于存放无菌培养液、试剂、培养瓶和样品，要求取放物品方便，环境也需要清洁、无尘。为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。冻存的温度一般为液氮温度-196℃。细胞的冻存过程需要一系列程序降温，一般为4℃下存放30min。转放-20℃1h，再转入-80—-70℃过夜，之后才可以转移到液氮内(-196℃)。因此储存区必须配备冰箱、低温冰箱、超低温冰箱和液氮罐等设备。4、准备区准备区用于配制培养液和有关培养用的液体等。应设有试剂柜、器械柜、实验台和上水道、电源等，配备的主要仪器设备有水纯化装置、天平、微波炉、pH计、抽气泵、电炉、培养分装器、各种规格的培养瓶、培养皿、移液管、烧杯、量筒、容量瓶等。在有天平、pH计、磁力拌器等设备下完成制备以后，应在无菌操作台进行过滤除菌。液体制备直接关系组织细胞养的成败，因此必须严格无菌操作。5、清洗区清洗区用于洗刷所有细胞培养器皿等，在实验室的一侧应设置专用的洗涤水池，用来洗玻璃器皿，备有各种瓶刷、去污粉、肥皂、洗衣粉等，中央实验台还应配置小水槽，用来清小型玻璃器皿。清洗区应配有柜子、加热器、蒸锅，洗刷器皿用的盆、桶等，有条件可配置玻器皿清洗机，此外还应配置落水架、干燥箱、超声波清洗器等。清洗区地面应耐湿，设置地并排水良好6、消毒灭菌区直接或间接与细胞接触的物品均需消毒灭菌处理。消毒灭菌区主要用于培养液的灭和各种器具的消毒灭菌，应备有高压蒸汽灭菌锅、细菌过滤设备、电热干燥箱、消毒柜、排风火设备等。清洗和消毒灭菌区应与其他区分开。三、动物细胞培养室的规章制度①每次实验前必须充分预习，熟悉实验操作中主要步骤和环节，了解仪器的性能和操方法。②严禁将与实验无关的物品带人实验室。③除严格按规程进行无菌操作，要培养良好习惯以防染菌或污染环境，并做好必要的全防护。实验前清洗双手，用75％酒精棉球擦手，用湿布擦净台面，必要时可用新洁尔灭(扎溴铵)溶液；进行接种操作时，要关闭门窗，以防空气对流，保持安静和良好秩序，尽量减少走动和说话，以防尘埃飞扬和唾沫飞溅；实验室内严禁吸烟和饮食；凡需进行培养的材料，应注明名称、接种日期及操作者姓名(或组别)，放在指定的培养箱中进行培养；带菌移液管、培养瓶、培养皿等器材，应置于专用盘、架，确定不再使用后，应立即投入消毒液中浸泡20min以上，或煮沸0.5h，或进行蒸汽灭菌后再清洗；离开实验室前要用肥皂洗手；实验室中物品未经许可，不得携带出实验室。④爱护仪器、设备，认真按操作规程使用仪器、设备，并作好使用记录。⑤认真做好细胞培养实验记录，以了解细胞生长情况，清晰填写实验报告。⑥发行意外情况时，应立即报告，在相关管理人员指导下及时处理。⑦节约水、电、试剂，适量取用实验药品等耗材。⑧实验完毕清除杂物，认真清洗器皿、清理试剂、清洁台面、保养仪器，物品归类还原。⑨值日生负责打扫实验室卫生，关好水、电、门、窗，经相关管理人员检查实验室安全，方可离开实验室。思考题动物细胞培养实验室包括哪些主要区域，每个区域的主要功能是什么？