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细胞培养技术CellCulture病理（肾脏）实验室白洁细胞培养概念：取动物组织，在体外，无菌条件下，模拟体内环境（营养、温度、pH值、气体），对其进行培养，使细胞能够生存、生长、保持原来生物学特性的一种实验方法。内容细胞培养的基本条件细胞培养基本实验一、细胞培养的基本条件实验室条件：环境、设备、器材、试剂实验操作者工作范畴：无菌操作、温育、培养液配置、洗刷、无菌处理、细胞和用品储存等back实验室条件无菌环境仪器设备普通器材一般试剂无菌室结构模式图back仪器设备超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜、液氮罐、低温冰箱、重蒸水装置、负压真空泵、普通冰箱、消毒锅、烤箱、水浴锅、天平等back二氧化碳培养箱back超净工作台back倒置显微镜back液氮罐back普通器材玻璃瓶皿：玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管、抽虑瓶等塑料瓶皿：多孔培养板、培养皿、培养瓶等back一般试剂培养液平衡盐液消化液抗生素液pH调整液backback培养液使用培养液：天然培养基5-20%合成培养基80-95%附加成分再加适量抗生素液，调整pH值即可back天然培养基小牛血清胎牛血清组织提取液back合成培养基RPMI1640Eagle培养液：DMEM、MEM、IMDMHamF12、HamF10、PC199Mc-Coy5Aback附加成分促贴壁物：层粘连蛋白等激素：胰岛素、氢化考的松、GH等生长因子：ECGF、NGF、FGF等酶抑制物：大豆胰旦白酶抑制剂等back平衡盐液HanksD-HanksEarlePBSHBSSback消化液胰蛋白酶(0.125-0.25%)胶原酶(0.1-0.3mg/ml)EDTA(0.01-0.02%)back抗生素液链霉素(100ug/ml)青霉素(100单位/ml)制霉菌素(100单位/ml)终浓度不超过万分之一为宜backpH调整液5.6%NaHCO2HEPES1NHCL10%HAC1NNaOHback无菌操作洗手着装近火焰操作试剂瓶等斜放实验前准备清洗：玻璃、塑料、橡胶、金属类等消毒：无菌室、培养用液、培养器皿（玻璃、塑料、橡胶、金属）等清洗示意图白箭头：玻璃制品黑箭头：橡胶制品back消毒方法物理消毒法：射线、紫外线、干热、湿热、过滤、煮沸等化学消毒法：乳酸、甲醛、过氧乙酸、新洁尔灭、乙醇等抗生素灭菌二、细胞培养的基本内容细胞传代培养*细胞冻存与复苏*细胞计数血细胞计数器：手工计数细胞Coulter计数仪：自动计数计算：以活细胞计数；成团细胞算一个细胞数＝4大格细胞数/4×104个/ml压线细胞计数原则：数上不数下，数左不数右常规观察培养液：颜色：含有指示剂酚红，颜色反应PH值新鲜的正常：PH7.2～7.4，桃红色；培养后，细胞产酸，变黄，需换液；透明度：清亮透明，混浊多为污染（悬浮细胞除外）培养液短期内变黄：1、是否有细菌污染；2、可能培养皿没清洗干净，有残留物；3、细胞生长太快；4、细胞接种量过大。细胞的生长状态贴壁细胞随贴附支持物形状不同而形态各异，最常见的是贴附于平面支持物细胞。在一般光镜下生存中的细胞是均质而透明的，结构不明显。细胞在生长期常有1-2个核仁，在细胞机能状态不良时，细胞轮廓会增强，反差增大。若胞质中时而出现颗粒、脱滴和腔泡等，表明细胞代谢不良。悬浮细胞圆形，可以单个细胞或聚集成团生长；细胞透亮，核、膜分界清楚；可大量繁殖，镜下可见分裂期细胞；肉眼可见在培养瓶中可沉底，轻轻晃动后均匀分布；培养基清亮。培养生长不好时，聚集成团的细胞少，生长慢，细胞有皱缩、破碎、透光性降低等现象。微生物污染传代或换液后24h～48h可观察到；细菌、真菌污染的典型表现：培养液混浊，液体内漂浮有菌丝或细菌；支原体污染：不明显，细胞生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现，但培养液多不发生混浊。细胞冻存与复苏细胞冻存（缓慢）细胞复苏（快速）冻存和复苏的原则：慢冻快融细胞冻存和复苏优点：细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少入力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化。细胞冻存方法配制冻存液：20%血清培养基＋10%DMSODMSO溶解要产热，应提前配，避免伤细胞。DMSO的作用收集对数生长期细胞，加入适量冻存液,用吸管吹打成细胞悬液（1×106～5×106细胞/ml)加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻批号。慢冻程序原则：当温度在-25℃以上时，1～2℃/min；当温度达-25℃以下时，5～10℃/min；当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。GMP程序：将冷冻管（管口朝上）放入纱布袋内，4°冰箱0.5h；－20°冰箱0.5h；－70°冰箱0.5h；转入液氮。简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。细胞复苏方法（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心5分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。结语细胞培养是一件繁琐、细致的实验！需要实验者具有缜密的思维及足够的耐心！谢谢聆听，共同学习！