SNP开发验证的研究方法和技术路线

SNP开发/验证的研究方法和技术路线1分子标记：分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。即使想要验证已经定位的QTLs，我们也需要相对应的区间内的分子标记，尤其是SNP标记。1.1全基因组SNP—Affymetrix芯片：一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单，高通量。可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。在国家玉米改良中心，有一套3k的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7,720条探针。而Affymetrix公司目前并没有相应的产品。但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为~2,500Mb，但是他们包括的基因数目~30,000个，整体情况相近。另外，番茄作为自交植物，其LD的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低。因此，综合考虑，我建议我们可以开发~3k芯片，应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面，芯片有其很高的应用价值。即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。1.2全基因组SNP—Douglas：当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs或是基因，我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也可以利用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间的基因型，而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1）。3）对于一些高信息量，均匀分布在全基因的SNP分子标记，可以用来构建番茄的指纹图谱。因此，一套完整能够与Affymetrix芯片相对应的SNP标记是必不可少的。图1.1QTL区间上的SNP标记分布图注：蓝色为深入片段，棕色为背景染色体。1.3Douglas系统下SNP标记的开发通过建立稳定、可靠的番茄DNA提取流程与优化PCR反应体系，筛选具有一致性、稳定性与多态性SNP分子标记引物，从而构建番茄全基因组SNP分子标记。全基因组的SNP分子标记，可以用于番茄QTL定位群体的检测，分子标记辅助育种的选择以及全基因组选择的群体基因型的检测。同时，从中挑选高质量，高信息量的分子标记用于构建一套完成的番茄指纹图谱，检测品种一致性。1.3.1供试材料：22份材料的DNA用作特异性引物筛选，2份水作为NTC（NoneTemplateControl），共计24份模板作为SNP引物的初期筛选。以上实验在Q6仪器上进行。对于筛选获得的一致性引物，在利用94株番茄自交系与2份水作为模板，进一步在Douglas仪器上验证。1.3.2DNA提取：1.取~10mg植物组织，加入研磨介质和400μl裂解液，研磨5min，3000g离心5min。2.加入裂解液1/3体积的提取液，旋涡振荡混匀，冰浴（或置于-20℃冰箱中）5min，于4℃，3200×g离心10min，吸取上清300~400μl加入到样品板中。3.按照下表在各96孔板中加入试剂：板号板型板名成分样品及试剂体积1Microtiterdeepwell96plate样品板（Lysis）样品反应液无水乙醇300~400μl400μl2Microtiterdeepwell96plate洗涤板I（W1）PW磁珠800μl30μl3Microtiterdeepwell96plate洗涤板II（W2）80%乙醇磁套800μl4KingFisher96KFplate洗脱板（Elution）TE1.050~100μl4.将各96孔板按仪器提示顺序放入仪器中，运行程序。5.程序运行结束后，将DNA溶液转移PCR板中并测量浓度（100ng/μl），进行后续实验或于-20℃保存待用。1.3.3分子标记命名：分子标记全部采用统一的命名规则，这样有利于结果的修改与维护。例如：名称IDSNP位点正向引物反向引物模板序列SolBeckman-00001-V1Sol00001A/G引物合成：由上海生工公司负责引物合成。1.3.4SNP分子标记的开发：最近，Sim等人利用番茄的Illumina芯片检测410份自交系与16份番茄品种的基因型。本研究在此基础上，利用Illumina开发的7,720条探针序列，选择其中丢失频率小于10%，等位基因频率大于10%的探针序列，获得~3,500条探针序列，作为SNP引物开发的模板序列（），每条序列的长度为~100bp，SNP上下游各50bp。初期，我们可以从~3500条探针中，选取~120探针序列作为模板发展引物，这120条序列要求分布在12条染色体上而且在每条染色体上尽量保证均匀分布。如果实验成功，我们可以逐步地将剩余的探针序列发展成为SNP引物。1.3.5正向引物设计：由于我们需要使用KASP基因分型检测试剂盒，本试剂盒对正向引物已经确定为SNP位点上游~20bp（包括SNP位点），同时需要人工加上FAM或是HEX序列（图1.2）。因此，我们需要单独设计反向引物。图1.2正向引物设计1.3.6反向引物设计：利用Primer3.0软件对模板序列进行引物选择，引物参数设定如下：1引物长度为18~25bp；2GC含量为40~60%；3TM值58~62°C。如果其上述模板序列不足以满足引物开发的需要：我们可以利用剩余~4,200条探针，继续开发新的引物。另外，我们还可以利用PCR产物测序的方式获得gap中序列，寻找新的SNP位点。1.3.6PCR反应：PCR反应体系：PCR反应体系需要保证均一化，这样可以满足将来在Douglas系统下进行SNP检测。初期我们会在Q6仪器上进行预实验，摸索一致后，再在Douglas系统中进行。PrimerMix反应体系：名称体积（μl）FAM-Primer12HEX-Primer12Reverse-Primer30ddH2O46Total100PCR反应体系：名称体积（μl）ReactionMix2.5PrimerMix0.7ddH2O0.8DNA1Total51.3.7PCR反应程序：我们的PCR产物应该都为100bp，因此我们可以采用统一设定，保证均一化。采用两步法进行PCR反应，前期筛选引物我们设计3个复性梯度：60°C、57°C以及55°C，以便找到最合适的复性温度。首先，利用60°C的复性温度进行筛选：步骤参数意义125°C1:30min反应前收集荧光294°C10min预变性394°C15s变性460°C1min复性，延伸53-4重复40个循环625°C1:30min反应完收集荧光如果SNP引物在60°C复性温度时扩增结果正常，则保留该引物在60°C复性进行PCR反应。如果得到引物扩增效果不好，则降低复性温度，利用57°C进行复性。57°C复性温度PCR反应程序筛选：步骤参数意义125°C1:30min反应前收集荧光294°C10min预变性394°C15s变性457°C1min复性，延伸53-4重复40个循环625°C1:30min反应完收集荧光如果SNP引物在57°C复性温度时扩增结果正常，则保留该引物在57°C复性进行PCR反应。如果得到引物扩增效果不好，则降低复性温度，利用55°C进行复性。最终，如果55°C复性温度时，反应结果不好，则该SNP引物剔除去掉。55°C复性温度PCR反应程序筛选：步骤参数意义125°C1:30min反应前收集荧光294°C10min预变性394°C15s变性455°C1min复性，延伸53-4重复40个循环625°C1:30min反应完收集荧光1.3.8SNP分子标记准确性验证：对于已在21份模板DNA扩增稳定的SNP引物，需要进一步在大群体中验证其稳定性、一致性、多态性。选择84份番茄自交系或品种的DNA，通过相同的PCR方法，验证新开发的SNP分子标记。1.3.9目标要求：番茄全基因组SNP标记：在番茄的全基因上，我们获得1200对特异的SNP引物（平均100对/染色体）覆盖番茄的全基因组。已获得在12份模板DNA能够稳定扩增的SNP分子标记，全部保留。2分子标记辅助育种：2.1ILs群体：如果利用现在群体不再进一步构建亚群体，ILs群体（Lpennellii渐渗系群体）~76个自交系，整个群体数目较小，不利于定位及QTLs验证（图2.1）。但是对于这些材料的渗入片段都已经注视清楚，因此我们可以直接比较深入系与M82自交系的表型差异，如果存在显著性差异，则可以定义为有深入片段引起的表型差异。当鉴定结果与已定位的QTLs信息一致时，我们就认为此QTL在区间内。同时我们要检索此QTL定位时的位置，以此为基础发展SNP标记，用于以后分子标记辅助育种。对于每个QTL的区间，需要发展4~8个SNP标记覆盖其定位区间（图1.1），其中，区间外两段各一个标记，内部2~6个SNP标记。这样可以保证目标QTL被完整的应用。SNP标记的开发，此时的SNP标记只需要在ILs群体的两个亲本中有多态性就可以应用。引物设计同全基因组SNP引物设计相同。性状验证：对于确定的QTLs，我们需要开发对应的SNP标记，利用这些标记重新验证定位结果：图2.1深入系材料的基因型2.2IBLs群体：IBLs群体本身就是分离群体，因此可以直接用作定位（图2.2）。如果该群体基因型已经被鉴定，我们可以直接利用鉴定的基因型结合我们自己调查的表型，获得QTL初定位的结果。同时，利用Affymetrix芯片进行全基因组的SNP检测，然后与表型数据相结合进行分析。然后，需要查看定位的QTL区间内是否存在3Douglas系统下SNP标记，如果满足分子标记辅助育种的应用，可以直接应用。如果QTL区间内的没有或是过少的SNP标记，则需要重新开发SNP标记（标记开发同上）。图2.2IBLs群体构建2.3性状调查：从我的观点出发，对于分子育种比较有价值研究的QTL，应为育种家需求的性状所对应的QTL。我认为我们需要跟番茄育种家合作并讨论育种需求与育种目标。鉴于目前ILs群体定位情况（表1，表2），我认为我们可以从中选择一些我们能够鉴定测量的性状进行研究，例如：糖分，可溶性固形物的含量，果实形状与大小等。总之我们要能够测量这些性状。同时，对于需要研究性状，我们需要对其进行界定，比如果实大小，我们需要测量成熟后几天的果实，作为统一的判定。以保证性状测量的准确性。为了能够获得准确的田间试验数据，应该采用良好的田间试验设计。在此，建议：现有的两个群体材料都为永久性群体，一般可以采用随机区组或是裂区设计，每个系2~3个重复，鉴定表型。因此我认为我们应该进行田间实验设计，保证表型数据的准确性。3SNP指纹图谱构建：通过已经获得的全基因SNP分子标记，进一步可以从中挑选出稳定、一致的48对SNP分子标记构建番茄的指纹图谱。挑选参数为：3.1等位基因频率（AlleleFrequency）在一个二倍体的某特定基因座上某一个等位基因占该基因座上等位基因总数的比率，是群体遗传结构的一个最基本的尺度，该基因座上所有等位基因的频率之和为1，对于SNP分子标记，一般只包括两种等位基因。因此，其等位基因频率在~0.5时为最适宜值。3.2多态性信息含量（PolymorphismInformationContent，PIC）：多态信息量(PolytnorphismInformationContent，PIC)由Botstein等在1980年提出，用