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第四节基因表达基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。最佳的基因表达体系：目的基因的表达产量高、表达产物稳定、生物活性高和表达产物容易分离纯化。一、宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞应满足以下要求:容易获得较高浓度的细胞；能利用易得廉价原料；不致病、不产生内毒素；发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；容易进行代谢调控；容易进行DNA重组技术操作；产物的产量、产率高，产物容易提取纯化。宿主细胞分为两大类：第一类为原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。⒈原核细胞⑴大肠杆菌因为大肠杆菌的分子遗传学研究深入，生长迅速，所以目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。其内毒素很难除去。⑵枯草芽胞杆菌分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。⑶链霉菌作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。⒉真核细胞⑴酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达⑵丝状真菌优点：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切糖基化）有成熟的发酵和后处理工艺。⑶哺乳动物细胞优点：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。缺点：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母,已建立了许多适合它们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。二、大肠杆菌中的基因表达载体基因工程的目的和基本手段，是选用合适的载体把供体DNA（外源基因）运载到受体细胞内，从而复制扩增大量的目的DNA分子或转录表达为相应的产物。基因工程载体分为：克隆载体转录载体表达载体克隆载体转录载体DNADNARNA蛋白质表达载体原核细胞的基因组特点：①染色质为环状双股DNA分子②具有操纵子结构③结构基因多为单拷贝④特定区域分布特异DNA顺序因此外源DNA分子可以插入原核细胞DNA复制体系的特定区段基因工程克隆载体的特点：①具有复制子②有单一限制内切酶切位点或多克隆位点③有选择性遗传标记如抗药基因④拷贝数高⑤生物安全性好目前使用的载体按特性可分为：①质粒②λ噬菌体③黏性质粒④M13噬菌体⑤酵母⑥真核细胞病毒载体细菌质粒的生物学特性质粒的定义：质粒是存在于细菌等微生物细胞染色质以外的共价闭环的双股DNA分子，具有独立自主复制和调控能力，可赋予宿主细胞一定的生物性状。质粒的生物学特性①大小小型质粒1.5～15kb,大型质粒60～120kb②复制类型:严紧型质粒,松弛型质粒③拷贝数④电泳特点⑤不相容性质粒的分类:⒈按复制型式①严紧型②松弛型⒉按基因转移性①传递性质粒②非传递性质粒⒊按遗传性状产物分类:①抗生素抗性②限制酶修饰酶系统⒈真核基因在原核细胞中表达载体必须具备条件：⑴载体能够独立复制。载体本身是一个复制子，具有复制起点。⑵应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记，以利于外源基因的克隆鉴定和筛选。⑶应具有很强的启动子，能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别。⑷应具有阻遏子，使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录。⑸应具有很强的终止子，只转录克隆的基因，所产生的mRNA较为稳定。⑹所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号AUG和SD序列，以便转录后顺利翻译。常用表达载体⑴pBV220系统质粒pBV220的结构pBV220系统国内使用最多的载体,其组成:①来源于pUC8多克隆位点②核糖体rrnB基因终止信号③pBR322第4225～3735位④pUC18第2066～680位⑤λ噬菌体cIts857抑制子基因及PR启动子⑥pRC23的PL启动子及SD序列pBV220系统优点：①cIts857抑制子基因PL启动子同在一个载体上，可以转化任何菌株，以便选用蛋白酶活性较低的宿主细胞，使表达产物不易降解。②SD序列紧跟多克隆位点，便于插入带起始ATG的外源基因，可表达非融合蛋白；③强的转录终止信号可防止出现“通读”现象，有利于质粒-宿主系统的稳定；④整个质粒仅为3.66kb，有利于增加其拷贝数及容量，可以插入大片段外源基因；⑤PR和PL启动子串联，可以增强启动作用；本系统宿主菌可以是大肠杆菌HB101、JM103、C600，质粒拷贝数较多，因此小量简便快速提取即可满足需要。本系统为温度诱导，外源基因表达量可达细胞总蛋白的20%～30%；产物以包含体形式存在不易降解均一性好；pBG-2是由pBV220系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。该质粒在PRPL启动子下游插入proteinG的IgGFc结合区基因片段180个碱基对，下游是多克隆位点，引入剪切融合蛋白具有与IgG结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。融合表达质粒pBG-2的结构⒉影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素外源基因表达产量与细胞浓度和细胞表达产量呈正相关。单个细胞产量取决于：⑴外源基因的拷贝数⑵外源基因的表达效率①启动子的强弱②核糖体接合位点的有效性③SD序列和起始密码ATG的间距④密码子组成⑶表达产物的稳定性⑷细胞代谢负荷⑸工程菌的培养条件⒊真核基因在大肠杆菌中的表达形式⑴以融合蛋白的形式表达药物基因以原核多肽和真核蛋白结合在一起称融合蛋白。优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；缺点：只能作抗原用。⑵以非融合蛋白的形式表达药物基因非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。优点：保持原有蛋白活性；缺点：易被蛋白酶破坏。⑶分泌型表达药物基因优点：在周质中稳定，有活性，不含蛋氨酸残基；缺点：产量不高，信号肽不被切割。三、酵母中的基因表达⒈载体酵母载体可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代DNA和RNA单位。⑴载体的复制系列可分四类：①Yep类（yeastepisomalplasmid，酵母附加体质粒）②YRp类（yeastreplicationplasmid，酵母复制型质粒）③YCp类（yeastcentromericplasmid，酵母着丝粒质粒）④YIp类（yeastintegrativeplasmid，酵母整合型质粒）⑵克隆载体⑶表达载体①普通表达载体②精确表达载体α-因子分泌型表达载体H：HindⅢ位点B:BamHI位点T:酵母主要蛋白酶加工位点⒉影响目的基因在酵母菌中表达的因素⑴外源基因的拷贝数⑵外源基因的表达效率①启动子②分泌信号的效率③终止序列的影响⑶外源蛋白的糖基化⑷宿主菌株的影响①菌体生长力强②菌体内源蛋白酶要较弱③菌体性能稳定④分泌能力强四、动物细胞中的基因表达哺乳动物细胞外源基因表达产物可由重组转化的细胞分泌到培养液中，使产物易纯化。基因产物糖基化接近天然产物。细胞生长慢，生产率低，条件刻苛，费用高，培养液浓度较小。表达的外源细胞均为传代细胞表达产物是否致癌尚有疑问。主要基因工程表达体系比较表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危性大肠杆菌多肽蛋白质菌体内容易一般对原核好不大融合蛋白质部分高产对真核差酵母多肽蛋白质菌体内容易菌体内真核的接近不大糖基化蛋白外分泌可高产稍复杂天然产物哺乳动物完整外分泌较难成本高简单可达天然需注意糖基化蛋白可高产产物致癌