第二章-蛋白质的定性定量分析课件

第二章蛋白质的定性定量分析蛋白质定性分析(qualitativeanalysis)确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在的是何种蛋白质蛋白质定量分析(quantitativeanalysis)确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白成分的含量蛋白质含量的测定方法（重点掌握）蛋白质相对分子量测定(SDS-PAGE)等电聚焦电泳(IEF)（一般了解）蛋白质的免疫印迹分析(westernblot)第一章蛋白质的含量测定蛋白质的含量测定基于蛋白质的元素组成特点基于蛋白质的化学显色反应基于蛋白质的光吸收特性蛋白质元素组成的特点各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据以下公式推算出蛋白质的大致含量：100克样品中蛋白质的含量(g%)=每克样品含氮克数×6.25×1001/16%一、紫外光谱(A280)吸收法这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋白质的洗脱峰原理色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法芳香族氨基酸的紫外吸收优点•快速缺点•核酸可引起强干扰作用•芳香族氨基酸含量差异可以起误差•对蛋白质无破坏性•不是严格的定量，适用于测定蛋白质粗提液计算方法•标准曲线法•蛋白质浓度(mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260注意事项•石英比色杯•调零所用溶液•配制标准蛋白所用溶液•光密度范围二、考马斯亮蓝G-250检测法这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法原理该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物在595mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595mn的光吸收值大小计算蛋白的含量所需时间•10min优点•快速（反应时间仅需2min）•敏感，几乎没有蛋白质损失缺点•用这种测定方法对蛋白质引起不可逆的变性•对各种纯化蛋白质反应不同计算方法•标准曲线法注意事项•反应10～15min后开始出现沉淀，尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条件下易发生沉淀•若选用目的蛋白来做标准曲线或用另一种方法来校正，所测蛋白浓度较准确三、Lowry检测法这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用.原理首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin-酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色，这种深蓝色的复合物在745～750nm处有最大的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比，可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量优点•一种可靠的蛋白质定量方法•不同蛋白质之间差别很小缺点•某些试剂不稳定•干扰物质多•使蛋白质发生不可逆变性计算方法•标准曲线法注意事项•在加入试剂30min后呈色达到饱和，时间延长颜色信号减弱•许多干扰物质降低颜色反应•高盐浓度可引起沉淀四、BCA(二喹啉甲酸)检测法这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法原理在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成稳定的有颜色的复合物，在562nm处有高的光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量优点•检测敏感性高缺点•蛋白质发生不可逆的变性•终产物稳定•巯基试剂和去垢剂干扰第二节蛋白质相对分子量测定分子量测定(molecularweight,MW)排阻层析沉降平衡超速离心动态弹性光散射孔径梯度电泳质谱(ESI-MS)一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量1.不连续系统原理2.SDS-PAGE凝胶的制备制备分离胶制备浓缩胶加样装板电泳卸板并进行凝胶染色3.SDS-PAGE基本原理SDS影响迁移率的因素十二烷基硫酸钠(SodiumDodecylSulfate)十二烷基磺酸钠(SodiumDodecylSulfonate)SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大于1mmol/L时，SDS与蛋白质的结合比例为1.4gSDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系WatchSDS-PAGE原理4.SDS-PAGE测定分子量的操作标准品的选择及处理待测样品的制备电泳分离及染色相对迁移率的计算WatchSDS-PAGE操作AnalysisforSDS-PAGEelectrophoresis5.注意事项选择合适的胶浓度样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去SDS与蛋白质之间的结合程度蛋白质的分子量范围15～200KD之间二硫键是否完全被还原溶液中SDS的浓度溶液的离子强度多亚基蛋白质分子量检测用其它方法测定分子量进行参照SDS和巯基乙醇SDS-PAGE测定的准确性电荷异常或构象异常带有较大辅基的蛋白质某些结构蛋白二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量1.基本原理2.凝胶过滤测定分子量的操作分子筛效应洗脱体积与相应分子量的关系装柱平衡加样平衡洗脱收集样品并计算Ve绘制标准曲线3.注意事项柱床表面不能干燥凝胶的选择Sephadex溶胀G值的意义凝胶柱的再生与保存第三节等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点等电点(isoelectricpoint,pI)两性电解质性质支持介质(supportingmedia)FigureofIEF+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10+–pH3pH7.5pH10IsoelectricFocusingReadyStripTMIPGStrips3–104–73–65–87–103–10NL3.9–5.14.7–5.95.5-6.76.3-8.3High-puritymonomersNarrowrangesforresolutionoflow-abundanceproteinsOverlappinggradientsfor“cybergels”Threelengths---7cm,11cmand17cm---0.5mmx3.3mmBroadRangepH3-10NarrowRangepH4-7MicroRangepH4.7-5.931044774.75.94.75.9第四节蛋白质的免疫印迹分析印迹技术(blotting)是指将存在于凝胶中的生物大分子转移（印迹）于或直接放在固定化介质上并加以检测分析的技术1975年，EdwenSouthern提出了分子印迹(渍)的概念目前这种技术已被广泛用于DNA、RNA和蛋白质的检测印迹技术的类别及应用DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究由于蛋白质常用抗体来检测，因此也被称为免疫印迹技术(immunoblotting)一、免疫印迹分析的应用对蛋白质进行定性分析对蛋白质进行半定量分析信号转导分析生物大分子相互作用分析二、免疫印迹分析的基本流程电泳分离蛋白转移至固相膜封闭非特异结合位点与第一抗体温育反应与第二抗体交联物温育反应显色制备蛋白样品蛋白质转移抗体检测免疫印迹操作流程图1.样品的制备组织或细胞中提取裂解去污剂(SDS、TritonX-100、NP-40、Tween-20)蛋白酶抑制剂(PMSF、EDTA、Pepstatin、Leupeptin、Aprotinin)蛋白质的定量(Bradford、BCA、Lowry)基因工程表达重组产物2.电泳分离SDS-PAGE非变性PAGEEIF3.蛋白质的电转移方法：半干法、湿法作用：将凝胶上的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上注意：在叠放硝酸纤维素膜、聚丙烯酰胺凝胶时，膜与胶之间要紧密贴在一起，中间不能有任何气泡！？常用的蛋白质转移膜种类微孔大小结合能力特点NC膜0.45um80-100ug/cm2应用广泛20kD易丢失PVDF膜0.22um0.45um80-100ug/cm2170-200ug/cm220kD不易丢失容量大、强度高尼龙膜480ug/cm2用于核酸电转移装置电转移示意图电转移装置4.靶蛋白的免疫学检测封闭—对转移膜上的潜在结合位点进行封闭，防止抗体非特异性结合在膜上，降低背景颜色BSA、脱脂奶粉靶蛋白与第一抗体反应—单抗、多抗注意：设立阳性对照和阴性对照，阴性对照可用免疫前血清、非相关单克隆抗体；阳性对照可用已知靶蛋白等作用：排除假象与第二抗体反应第二抗体一般是针对第一抗体的免疫球蛋白，可用同位素或非同位素物质进行标记酶标抗体常用酶：碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)胶体金标记、125I标记标记显色—AKP可催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(bromochloroindolylphosphate，BCIP)与氮蓝四唑(niro-bluetetrazolium，NBT)发生反应，产生深蓝色化合物，显示出蛋白质所在的位置。Watchprocedure—HRP可催化底物显色生成棕色化合物，显示出蛋白质所在的位置四、免疫印迹注意事项SDS-PAGE凝胶的浓度膜的选择电转移（方向、电流、转移效率）充分封闭和洗膜抗体的使用（稀释比例、分装）免疫检测（显色）