基因工程实验4：聚合酶链式反应技术

基因工程实验——实验四：聚合酶链式反应技术（PCR技术）安徽大学生命科学学院实验目的与要求掌握PCR反应原理学习引物序列的设计学习PCR反应体系的设计学习PCR反应程序参数的设计学习通过聚合酶链式反应(PCR)在体外大量扩增位于两段已知序列间的DNA区段。安徽大学生命科学学院一实验原理二实验材料三实验步骤四预期结果五注意事项安徽大学生命科学学院一、实验原理1、聚合酶链式反应技术简介2、基本原理及特点3、一个典型反应的反应体系及程序参数介绍4、DNA聚合酶5、寡核苷酸引物的设计安徽大学生命科学学院1、聚合酶链式反应技术简介聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)简称ＰＣＲ技术，是1983年，美国科学家K.B.Mullis发明的一种体外快速扩增特定基因或ＤＮＡ序列的方法。PCR技术已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基因检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。安徽大学生命科学学院2、PCR技术基本原理及特点PCR技术实际上是在模板DNA、引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，大量扩增位于两段已知序列间的DNA区段。反应主要涉及三个反应的循环：①高温变性（denaturation），发生链的分离；②低温退火（annealing），发生引物杂交；③适温延伸（extension），发生DNA合成。反应过程见图。安徽大学生命科学学院PCR反应循环示意图5’3’3’5’94℃高温变性双链DNA分离出2条单链DNA分子47℃低温退火5’3’3’5’一对特异性引物分别结合到两条单链模板DNA上。上游引物下游引物72℃适温延伸5’3’3’5’在DNA聚合酶的作用下，dNTPs从引物3’端开始参入，并沿着模板从5’向3’方向延伸，合成出新生的DNA互补链。1个分子2n个分子n个循环安徽大学生命科学学院3、一个典型反应的反应体系及程序参数介绍反应体系：反应物终浓度10×buffer2μL4×dNTPs(1mM)800μmol/LMgCl2(25mM)1.5mmol/LDNA聚合酶1U上游引物P1400pmol/L下游引物P2400pmol/L模板ＤＮＡ(20ng)补水至总体积20μL反应参数：温度时间９4℃2min９4℃45s??℃45s72℃50s72℃5min4℃hold20个循环安徽大学生命科学学院①PCR缓冲液含50mmol/LKCl及Tris-HCl（pH8.3）②MgCl2二价阳离子对于酶活性是必须的，Mg2+优于Mn2+，而Ca2+无效。Mg2+的最佳浓度相当低（一般1.5mmol/L），且模板DNA中的EDTA及dNTPs中的负电离子基团——磷酸根等都会影响到Mg2+的有效浓度。在开始新的PCR组合时，可在0.05mmol/L~5mmol/L之间，设0.5mmol/L的梯度，进行PCR，来摸索最佳Mg2+浓度。③dNTPs（四种脱氧核糖核苷三磷酸）在饱和浓度下使用，即每种200μmol/L。④模板DNA闭环靶序列DNA的扩增效率略低于线状DNA。对哺乳动物基因组DNA扩增，每次反应约需1~0.1μg，对于细菌或质粒DNA，仅为pg（10-12g）到ng（10-9g），还可以直接以细胞为模板。3、一个典型反应的反应体系及程序参数介绍安徽大学生命科学学院4、DNA聚合酶（1）Taq酶TaqDNA聚合酶是于1986年从一种生活在75℃热泉中的栖热水生菌中分离纯化出来，具有3个重要的特性：①耐高温最适温度是72℃，连续保温30min，仍具有相当的活性，且在比较宽的温度范围内都保持着催化DNA合成的能力。②具有腺嘌呤脱氧核苷三磷酸末端转移酶活性使扩增的DNA的3’端多带上一个“A”，有利于进行TA克隆。③在体外，失去3’—5’方向外切酶校正活性，有参错情况出现。在一次典型的PCR反应中，其参错率约为1/2*104核苷酸，在体内是1/109核苷酸。（2）高保真酶但没有腺嘌呤脱氧核苷三磷酸末端转移酶活性，引物需要设计限制性酶切位点，以便后续的克隆。（3）酶量控制根据片段长短，循环数多少。并非越多越好，加酶过多，会导致非靶序列扩增。安徽大学生命科学学院5、寡核苷酸引物的设计引物引物3’5’5’5’基因组*引物的序列及其与模板结合的特异性是决定PCR反应结果的关键。*引物设计的主要原则是最大限度地提高扩增效率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。安徽大学生命科学学院5、寡核苷酸引物的设计引物设计关键点①与模板的互补及错配情况：应有效结合到目的序列上，尽可能不与其他部位结合。且两引物的结合位点之间一般为1~2kb，超过3kb扩增效率大大降低。3’端要求完全互补，尤其3‘端最后5~6个核苷酸的错配应尽可能的少。一般5’端可以添加一些限制性酶切位点及其保护碱基，不会影响引物特异序列的退火。②引物长度：一般为20~30个碱基长，最低不能少于16个。引物太短很可能会同非靶序列杂交，得到非预期的扩增产物。一般每增加一个核苷酸，引物特异性提高4倍。但不能太长，太长增加成本，且引物同模板DNA的杂交速率下降，影响PCR反应效率。③引物序列：尽量使其GC含量为50%左右，避免出现多个嘌呤或嘧啶，以防止形成二级结构，避免出现连续4个以上同一个碱基。3’端应选用AT，少用GC，可提高引发效率，避免假引发。安徽大学生命科学学院④引物二聚体：特别要注意引物之间不能互补，尤其在3’末端，否则，就会发生退火，出现引物二聚体的扩增，与天然模板之间产生竞争的PCR状态，从而影响扩增成功。若一个反应中加入多对引物，应将其进行交叉配对检验，若仍有二聚体出现，则改变Mg2+浓度，可降低其含量。⑤引物Tm值：15~25nt时，Tm=4℃*（G+C）+2℃*（A+T），大于25nt，则要考虑热动力学参数，可用软件计算。两条引物的Tm应尽可能相等或相近，最好相差不超过3℃。退火温度决定于Tm值，它影响引物与模板的结合效率。引物容易结合到模板上的温度是Tm减15℃~25℃，但退火温度太低会导致特异性丧失。在Tm值允许的范围内，选择较高的温度，可大大减少引物和模板之间的非特异性结合，从而提高PCR的特异性。所以为了兼顾引物结合效率和扩增特异性，人们采用的退火温度为Tm减5~15℃。⑥引物浓度：通常1μmol/L足以完成30个循环，浓度过高会导致非特异性扩增或引物二聚体扩增，浓度不足则会降低PCR效率。5、寡核苷酸引物的设计安徽大学生命科学学院二、实验材料l、仪器和材料PCR扩增仪，台式高速离心机，Ep管(0.2mL)，微量取液器，20μL和200μL吸头2、试剂(1)TaqDNA聚合酶(5U/μL)(2)dNTPs混合液(3)引物DNAP1:5’GTAGTCATATGCTTGTCTC3’19ntTm=54℃P2:5’CTTCCGTCAATTCCTTTAAG3’20ntTm=56℃(4)模板DNA:含有约1138bp长目标基因的质粒安徽大学生命科学学院5’GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTAAAAGCAATTTP1：5’GTAGTCATATGCTTGTCTC3’TTACAGCGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATGATCTACATGGCAATGTATTTTTTACTATTGGATAACCGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCAAAAAAGGGGTGCTTTACGGCACTCTGCACTTATTAGATCAAAGCCAACAGCCTGGAAACAGGTTTCTTTTGGTGAATCATAATAATTAAGCGGATCGCATGGCCTTGTGCCGGCGACGGTTCATTCGATTTTCTGCCCTATCAGGCTTTTGATGGTAAGGTAGTGGCTTACCATGGCTATCACGGGTGACGGGGAATAAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGATTCGGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATGCAGAGCCTTTCAGGTTTTGCAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCTCTTAACGAGAACCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAACGTCCGTAGTCGAACTTTGGGTTTGGGCTTGTGCCTGGCGTCCTTCATTGGGCGTTTGGGTTGCATGCCTTGCCATGTTGTAGGGGTGCAGTCTTTCGGGGCTGATGATCTCTGCGTATTACCATGAGCAAATCAGAGTGCTCAAAGCAGGCTTTATAGCTTGAATGTTTTAGCATGGAATAATGAAATAAGCCTTAGGTCTTGTTTCGTTGGTTTACTTGACACTGGGGAATGATGAATAGGAACGGTTGGGGGCATTTGTATTTGGCCGCTAGAGGTGAAATTCTTGGATTGGCCGAAGACAAACTACTGCGAAAGCATTTGACCCAGGACGTTTTCATTGATCAGGGACTAAAGTTGAGGGATCGAAGACGATTAGATACCGTCGTAGTCTTAACCACAAACTATGCCGACTAGCGATCGCATGGATACTTTTTTTGTTCTATGCGGCAGCTTAGCGAAAGTAAAGTCTTTGGGTTCTGGGGGGAGTATGGGACGCAAGGCTGAAACTTAAAGGAATTGACGGAAG3’P2：3’GAATTTCCTTAACTGCCTTC5’安徽大学生命科学学院三、实验步骤1、PCR反应扩增目标片段（1）PCR循环仪预热（2）按以下反应体系，将各成分在一个灭菌的0.2mLEp管内混合：反应体系：反应物终浓度所加体积10×buffer2μL2μL4×dNTP(10mM)800μM0.4μLMgCl2(25mM)2.5mmol/L2.0μLDNA聚合酶2U0.4μL上游引物P1400pmol/L0.8μL下游引物P2400pmol/L0.8μL模板ＤＮＡ(20ng)0.5μL补水至总体积20μl20μL用手指在管壁上轻弹几下，混匀上述反应混合物，高速离心机离心10s，使反应液集中在管底。安徽大学生命科学学院三、实验步骤（3）待PCR仪预热后，将上述反应混合液放于PCR仪的小池中。（4）按以下程序输入扩增仪，进行PCR扩增反应参数：温度时间９4℃3min９4℃50s47℃50s72℃100s72℃5min4℃hold30个循环安徽大学生命科学学院三、实验步骤2、扩增产物的电泳检测（1）配置1%的琼脂糖凝胶；（2）在PCR反应小管中加入2.3μL10*loadingbuffer，混匀，取8μL上样电泳。70V~100V。Marker：DL2000（3）紫外检测。安徽大学生命科学学院四、预期结果安徽大学生命科学学院五、注意事项1、注意PCR仪的使用；2、除特别指出外，加入反应成分及每一步骤间隙均需在冰上进行；3、加入TaqDNA聚合酶后，要充分混匀体系，并用离心机轻甩一次。安徽大学生命科学学院实验安排8:30—9:30讲课9:30—10:00分组学习PCR仪的使用10:00-10:20混合反应体系10:20—12:30进行PCR反应，配制琼脂糖凝胶及缓冲液1:30—2:30琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物安徽大学生命科学学院THEEND