微生物诱变育种

第四章微生物诱变育种诱变育种：是以人工手段诱发微生物基因突变，改变其遗传结构和功能，从多种多样的突变体中筛选出产量高、性状优良的突变株，并设计出适合该突变株最佳的培养基和条件，使其在最适的工艺条件下最有效地合成产物。基因突变是微生物变异的主要源泉，人工诱变是加速基因突变的重要手段。诱变育种有以下几个优点：速度快、收效大、方法简单。分三个阶段：菌种基因型改变，突变体筛选，产量评估1.遗传性状稳定2.纯净无污染3.繁殖力强、生长速度快、短时间内能产生所需产物4.能诱变产生遗传性变异5.具有产量高、收得率高理想的工业生产菌种必须具备：•出发菌株的选择•单孢子（单细胞）悬液的制备•诱变剂及诱变剂量的选择•诱变处理方法•高产菌株的分离第一节诱变育种的步骤对出发菌株的要求：1.对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高2.具有一定生产能力3.具有有利性状，如生长速度快、营养要求低以及产孢子早而多的菌株一、出发菌株4.有时可考虑选择已发生其他变异的菌株作为出发菌株。5.采用一类被称为“增变菌株”的变异菌株，它们对诱变剂的敏感性比原始菌株大为提高，更适宜作为出发菌株。6.在选择产核苷酸或氨基酸的出发菌株时，应考虑能累积少量所需产物或其前体的菌株;而在选择产抗生素的出发菌株时，最好选择已通过几次诱变并发现每次的效价都有一定程度提高的菌株作为出发菌株。连续诱变育种过程中如何选择出发菌株?突变株的产量是数量遗传，只能逐步累加，一次性大幅度提高发酵水平不太容易。在选择出发菌株时，应挑选每代诱变处理后均有一些表型上改变的菌株，如发酵单位有一定程度的提高、形态上发生过一次变异或产生过回复突变的菌株等，以利于突变率的增加菌号诱变代数菌落大小/cm菌落表面结构菌落颜色可溶性色素变株效价提高/%454111.3平滑疏松龟背灰绿赭石10071046100.8平滑紧密白火泥棕2011B-53110.6平滑紧密白海螺橙2642C-04自然分离后0.5平滑紧密白淡可可棕3547D-756130.4平滑紧密白鱼鳃红6911灰黄霉素高产菌D-756诱变系谱菌株表型变异与产量递增的关系二、单孢子（单细胞）悬液的制备对菌悬液的制备有如下的要求：1.供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮2.供试细胞培养物要新鲜3.菌悬液中的菌体应该是单细胞或单核的孢子制备方法：1.采取分散法2.菌悬液中细胞的浓度，要求霉菌孢子浓度约为106/ml，放线菌孢子浓度约为106-107/ml。3.制备菌悬液通常采用生理盐水。如果用化学诱变剂处理时，应采用相应的缓冲液配制，以防处理过程中pH变化而影响诱变效果。1.诱变剂种类选择对遗传稳定的出发菌株，最好采用以前未使用过的、突变谱较宽的、诱变率高的强诱变剂。对遗传不稳定的出发菌株，采用温和诱变剂。对诱变史较长的高产菌株，如多次使用某一诱变剂，可能出现“钝化”现象，此时则需改用另外的诱变剂。三、诱变剂及诱变剂量的选择2.最佳剂量的选择：经长期诱变后的高产菌株、遗传性状不太稳定的菌株，宜用较温和的诱变剂和较低剂量处理。要筛选具有特殊性状的菌株、较大幅度提高产量的菌株，则用强诱变剂和高剂量处理。对野生低产菌株，开始用高剂量，然后逐步用低剂量处理。对多核细胞菌株，用高剂量处理。诱变处理方式：单因子处理：是采用单一诱变剂处理（一般突变率低）复合因子处理：是指采用两种以上诱变因素处理（突变率高）分下列几种情况：1.两个以上因子同时处理2.不同诱变剂交替处理3.同一诱变剂连续重复使用4.紫外线光复活交替处理四、诱变处理方式随机突变，定向筛选。筛选的条件决定了选育的方向，设计一个好的筛选方案是诱变育种的重要前提。五、突变体的分离和筛选出发菌株诱变绝大多数个体死亡少数存活少数突变多数未变多数负变少数正变少数变幅大多数变幅小少数宜投产多数不宜投产存活率突变率正变率高产率投产率第一代：出发菌株分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）挑选菌落200个初筛1瓶/株3-5株（提供第二代诱变出发菌株）诱变50株复筛常规筛选程序：第二代：出发菌株4株分离到平皿上（有时还结合指示剂，呈色剂或底物等）挑菌落初筛1瓶/株3-5株（提供第三代诱变出发菌株）诱变挑50株复筛100个100个100个100个第一代：出发菌株分离到平皿上打琼脂块挑菌落1000-3000块挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落选3-5株（提供第二代诱变出发菌株）诱变初筛置于检定板上选30-50个菌株复筛简便筛选程序第二代：出发菌株4株分离到平皿上打琼脂块挑菌落1000-3000块挑取5-10%透明圈、呈色圈、抑菌圈大的菌落选3-5株（提供第三代诱变出发菌株）诱变初筛置于检定板上选30-50个菌株复筛青霉菌的选育2U/ml85000U/ml营养缺陷型的诱变方法和所用的诱变因子与普通诱变育种基本相同，只是由于营养缺陷型属于单一基因突变，各种诱变剂的功能不同，有的不宜作为营养缺陷型诱变剂。第二节营养缺陷型菌株的筛选一、营养缺陷型菌株的分离和筛选一般包括：诱发突变、淘汰野生型菌株、检出缺陷型、鉴别缺陷种类等4个步骤。（一）营养缺陷型的诱发常用的方法有抗生素法和菌丝过滤法。（二）淘汰野生型菌株1.抗生素法常用于细菌和酵母菌营养缺陷型菌株的富集，前者用青霉素法，后者用制霉菌素法。青霉素法的原理为：细菌细胞壁的主要成分为肽聚糖类，而青霉素能抑制细胞壁肽聚糖链之间的交链，阻止合成完整的细胞壁。处在生长繁殖过程的细菌对青霉素十分敏感，因而被抑制或杀死，但不能抑制或杀死处于休止状态的细菌。制霉菌素法原理：制霉菌素作用于真菌细胞膜上的甾醇，引起细胞膜的损伤，杀死生长繁殖过程的真菌，起到富集营养缺陷型菌株的作用。1.诱变后的菌体用完全培养液振荡培养2-3代，以结束表型延迟现象2.进行离心、洗涤，转移到基本培养基中进行饥饿培养4-6h3.转移到含无机氮的培养基中培养3-4h，加入一定浓度的青霉素4.经涂布培养后，统计完全培养基和基本培养基上菌落的差数，确定产生最多缺陷型的青霉素溶度青霉素淘汰细菌野生型细菌的步骤：2.菌丝过滤法真菌和放线菌等丝状菌的野生型孢子在基本培养基中能萌发长成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能萌发。把诱变处理后的孢子移入到基本培养液中，振荡培养10h左右，使野生型孢子萌发的菌丝刚刚肉眼可见，用灭菌的脱脂棉、滤纸或玻璃漏斗除去菌丝。继续培养，每隔3-4h过滤一次，重复3-4次，最大限度地除去野生型细胞。然后稀释，涂皿分离。3．高温差别杀菌法利用芽孢菌类的芽孢和营养体对热敏感性的差异。在基本培养液中，野生型芽孢可以萌发，而营养缺陷型芽孢不能萌发。此时将培养物加热到80℃，维持一定时间，野生型细胞大部分被杀死，缺陷型则得以保留，起到了浓缩作用。1.点植对照法三、营养缺陷型的检出CMMMCM2.影印法1.防止菌落扩散和蔓延可以在培养基中加入0.5％左右的脱氧胆酸钠，或在基本培养基中用山梨糖作为碳源，再加入适量蔗糖使菌落长得小而紧密。2.克服孢子扩散而带来不纯现象在完全培养基上的菌落尚未形成孢子之前，用一张灭菌的薄纸覆盖琼脂平板上，待菌落的菌丝长到纸上后，把纸转移到基本培养基平板上。薄纸上的菌丝向基本培养基表面生长，便在相应位置上长出菌落。采用影印法检出霉菌营养缺陷型时，要注意两点：3.夹层法4.限量补充培养法该法有两种情况，如果试验的目的仅是检出营养缺陷型菌株，则其方法是将富集培养后的细胞接种到含有0.01％蛋白胨的基本培养基上，培养后，野生型细胞迅速地长成大菌落，在平皿底部作好颜色标记，而生长缓慢的小菌落可能是缺陷型，此称限量培养。1.鉴定方法营养缺陷型的鉴定方法可分成两大类：一种方法是在一个子皿中加入一种营养物质以测定多株缺陷型菌株(10-50株)对该生长因子的需求情况。第二种方法是在同一平皿上测定一种缺陷型菌株对许多种生长因子的需求情况，称为生长谱法。四、营养缺陷型的鉴定2.营养缺陷型鉴定步骤：测定缺陷型菌株所需生长因子的类别具体测缺陷该类别物质中的哪种生长因子用单一生长因子进行复证试验。①氨基酸混合物、酪素水解物或蛋白胨，代表氨基酸类。②酵母浸出液，其中氨基酸、维生素、嘌呤、嘧啶均具有。③维生素混合物，代表维生素类。④核酸碱基混合液或酵母核酸(0.1％碱水解物)，代表嘌呤、嘧啶类。通常分别用以下物质来代表氨基酸、维生素、核酸碱基：(1)缺陷型类别的测定先选择缺陷型菌株所需用的类别代表物质：用于营养缺陷型测定的氨基酸有21种。一般用L-型氨基酸，而DL-型氨基酸虽然也可以使用，但要增加1倍的浓度。D-型氨基酸由于微生物难以吸收利用，不能使用。用于鉴别缺陷型菌株的维生素约有15种。核酸碱基有7种，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、黄嘌呤、次黄嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶及胸腺嘧啶。要鉴定单缺氨基酸或维生素的营养缺陷型，较为简便的方法是分组测定法。把21种氨基酸，组合6组，每6种不同氨基酸归为一组。(2)缺陷型所需生长因子的测定组别一17891011二2712131415三3812161718四4913161920五51014171921六61115182021组合生长因子生长因子的配制方法：把同一组的氨基酸粉末混合置于洁净的瓶中，加入灭菌的蒸馏水，充分溶解，置冰箱保存。配制浓度：用于放线菌测定的氨基酸约1mg／ml用于霉菌测定的约10mg／ml维生素一般0.1mg／ml生物素、维生素B12约0.01mg／ml测定方法：缺陷型菌株和基本培养基混合制成平板，把6组生长因子直接点加于同一琼脂平板上，或用滤纸片沾取后覆于琼脂平板上，培养后，观察哪一组或哪两个组区产生混浊生长圈，即可确定该菌株缺陷的生长因子。1.生产上：微生物育种，协助解除代谢反馈调控机制，达到大量积累终产物的目的天冬氨酸-β-半醛二氨基庚二酸赖氨酸高丝氨酸甲硫氨酸苏氨酸2.作为杂交育种、重组育种的遗传标记3.遗传学研究中，转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子研究中的标记。五、营养缺陷型突变株的应用O-琥珀酸高丝氨酸天冬氨酸Asp天冬氨酰磷酸天冬氨酸-β-半醛ASA高丝氨酸Hse二氨基庚二酸DAP赖氨酸高丝氨酸磷酸苏氨酸Thr甲硫氨酸Met异亮氨酸Ile优先合成反馈抑制①②③④⑤AspASADDPDAPLysHseMetThrIleAspASADDPDAPLysHseMetThrIleLeuAspASADDPDAPLysHseMetThrIle谷氨酸棒状菌、黄色短杆菌乳糖发酵短杆菌大肠杆菌本章思考题：1.何谓诱变育种？试述诱变育种在发酵工业中的作用和地位2.在发酵工业生产中，理想的生产菌种应具备哪些性状？3.在诱变育种时，出发菌株如何选择？对菌悬液有何要求？4.针对不同微生物，如何选择诱变剂和诱变剂量？5.筛选产量突变株时，应考虑哪些基本环节？6.试述筛选产量突变株的简便程序。7.营养缺陷型菌株的分离和筛选有哪些步骤？8.淘汰野生型菌株的方法有哪些？分别简述其原理？9.试述营养缺陷型检出和生长谱鉴定的方法？10.设计通过UV诱变大肠杆菌而得到组氨酸营养缺陷型突变株的实验程序或方案。