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27罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)为革兰氏阳性菌，天然存在于哺乳动物及鸟类的肠道中。罗伊氏乳杆菌能够产生一种被称作“reuterin”的广谱抑菌物质[1]，能促进肠道健康[2，3]、口腔健康[4、5]、对某些致病菌有很强的抵抗力[6]、降低肝脏伤害后发生的微生物菌群的紊乱[7]、缓解抗癌药methotrexate在高剂量时引起的严重小肠结肠炎[8]。我国卫生部2003年批准罗伊氏乳杆菌为可用于保健食品的益生菌菌种。该菌株的人体摄入安全性可由若干体外和动物临床研究所保证。它可用于各种食品、保健食品和微生态制品或药品。罗伊氏乳杆菌的益生功能已经为人们所熟知，但很少有人研究其是否能产生细菌素，进而抑制其它细菌。本研究的目的是检测罗伊氏乳杆菌能否产生细菌素，并研究其所产生细菌素的部分特性。1材料与方法1.1材料与仪器罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)6126：购自中国工业微生物菌种保藏中心；指示菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcustlureus)、大肠杆菌O1(EscherichiacoliO1)由山东宝来利来生物工程股份公司生物研究院保存。益生菌培养基：改良MRS培养基；指示菌培养基，肉汤培养基；固体培养基中加入1.5%罗伊氏乳杆菌所产细菌素的研究山东宝来利来生物工程股份有限公司/徐海燕曹银生张志焱崔诗法曹斌谷巍摘要试验对罗伊氏乳杆菌6126的发酵上清液进行了系统研究。结果表明：罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液可以产生细菌素，并研究了6126发酵上清液中细菌素的部分特性。该细菌素抑菌谱广，可以抑制多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，对热(100℃，30min)和pH(2.0～10.0)稳定，胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K等多种蛋白酶可使其部分失活。关键词罗伊氏乳杆菌；细菌素；特性AbstractThisstudyascertainedthatLactabacillusreuteri6126couldproducebacteriocin.Thefermentationsupernatantofthestrainexhibitedabroadspectrumofantagonisticactivityagainstvariousspeciesgram-positiveandgram-negativebacterium.Thefermentationsupernatantofthestrainwasheat-stable(30minat100℃)andremainedactiveafterincubationfrompH2.0to10.0.Thefermentationsupernatantofthestrainwasfoundtobesensitivetoproteolyticenzymes(pepsin,trypsin,papain,proteinaseK).KeywordsLactabacillusreuteri;bacteriocin;characteristic中图分类号：S816.73文献标识码：A文章编号：1006-6314(2011)09-0027-04通讯作者：徐海燕，畜牧师。收稿日期：2011-7-1。28的进口琼脂粉。PHS-3C型精密pH计；YJ-875B垂直净化工作台；数显恒温水浴锅；手提式压力蒸汽消毒器；恒温培养箱；冷冻高速离心机。1.2方法1.2.1抑菌活性的测定1.2.1.1指示菌菌悬液的制备：从斜面挑取一环接种于肉汤培养基中，于37℃摇瓶培养18h，用无菌生理盐水稀释成10-3菌悬液，活菌数为106个/mL。1.2.1.2益生菌发酵上清液的制备从罗伊氏乳杆菌6126斜面上挑取一环至改良MRS液体种子培养基中，37℃静置培养24h，然后以2%的接种量接种到改良MRS培养基中扩培一次，37℃静置培养28h即为发酵液，6000rpm离心15min，收集上清液，备用。1.2.1.3细菌素抑菌活性的检测—牛津杯法[9]双碟的制备：取直径90mm的培养皿，注入灭菌的营养琼脂(1.5%)15mL，水平放置使之凝固，作为底层，另取指示菌培养基(浓度为0.8%，冷却至50℃左右)与指示菌菌液适量混匀，取6mL铺在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层。加样品：用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。在牛津杯中加满相同量的罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液(300μL)，每个样品三个重复。将加完样的培养皿小心放入37℃恒温箱内，培养18h(其中以真菌做指示菌的培养时间为30℃、3d)后取出测量抑菌圈直径。1.2.2罗伊氏乳杆菌6126产生抑菌物质的抑菌谱选取金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、鸡大肠杆菌、猪大肠杆菌、鸡伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉等作为指示菌，测定其发酵上清液的抑菌活性。1.2.2.1抗细菌活性试验：牛津杯法，同1.2.1.3。1.2.2.2抗真菌活性试验—牛津杯法孢子悬液的制备：向培养好的真菌斜面上注入5mL无菌生理盐水，洗下孢子制成菌悬液(含107孢子/mL)。双碟的制备以及加样品同1.2.1.3，其中菌层指示菌为真菌孢子悬液。1.2.3罗伊氏乳杆菌6126产细菌素的鉴定微生物发酵后能够产生多种抑菌物质，如有机酸(乳酸、乙酸)、过氧化氢等，因此在细菌素产生菌的筛选中需要排除这些因素的干扰。因此，下面主要设计试验来排除酸性物质、过氧化氢的干扰，并初步确定其抑菌物质是蛋白类物质。选择金黄色葡萄球菌及大肠杆菌O1为指示菌。1.2.3.1酸性产物抑菌作用排除试验将罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液用10mol/L的氢氧化钠溶液调pH值6.5～7.0，以中和有机酸的干扰。1.2.3.2过氧化氢抑菌作用排除试验用50mmol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH6.5)配制20mg/mL的H2O2酶溶液，在0.1mL酶溶液中加入0.4mL培养代谢产物，使酶的终浓度为4mg/mL。37℃水浴2h后取出，与加入等量磷酸盐缓冲液的无细胞发酵上清液对比抑菌活性的大小，以排除代谢产物中的H2O2抑菌作用。1.2.3.3蛋白类抑菌物质的确定将罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液调至胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶作用的最适pH值(分别为2.0、7.5、7.5和6.5)，按终质量浓度1.0mg/mL分别加入上述各酶液，在上述各蛋白酶的最适温度下(分别为40℃、37℃、58℃和55℃～60℃)恒温水浴酶解2h后，将酶解液的pH值调回原发酵液的pH值，以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌O1为指示菌，以未酶解处理的发酵上清液为对照，管碟法进行体外抑菌试验。1.2.4罗伊氏乳杆菌6126生长曲线及抑菌活性曲线的测定罗伊氏乳杆菌6126以2%的接种量接种于改良MRS液体培养基中，37℃静置培养，于0h、4h、8h、12h、16h、18h、20h、24h、28h、30h取样，计数并测定发酵上清液(pH7.0)的抑菌活性。1.2.5罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液对温度及pH值的敏感性1.2.5.1对温度的敏感性分别取5mL发酵上清液(pH6.5～7.0)于9支试管中，在60℃、80℃和100℃下处理10min、30min和60min，冷却后检测其抗菌活性。1.2.5.2对pH值的敏感性分别取5mL透析液于8支试管中，用4mol/L的盐酸或4mol/L的氢氧化钠溶液将发酵上清液pH值调至2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，室温下保持24h后将各管的pH值调回7.5左右，检测其抗菌活性。2结果与分析2.1罗伊氏乳杆菌6126的抑菌谱结果见表1。29表1罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液的抑菌谱指示菌抑菌圈直径(mm)藤黄八叠球菌20.7金黄色葡萄球菌18.8鸡大肠杆菌16.5猪大肠杆菌15.3鸡伤寒沙门氏菌15.8植物乳杆菌12.5枯草芽孢杆菌14.5乳酸链球菌13.2鸡白痢沙门氏菌15.1黑曲霉13.2根霉13.5米曲霉12.4可知罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液对所试验的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌以及霉菌均有不同程度的抑制作用，表明罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液的抑菌作用是比较广谱的。2.2罗伊氏乳杆菌产细菌素的鉴定2.2.1酸性产物抑菌作用排除试验结果见表2。表2酸性产物抑菌作用排除试验项目罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液pH6.5～7.0大肠杆菌O1金黄色葡萄球菌抑菌圈直径(mm)16.518.5由结果可知，罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液调pH值6.5～7.0，中和有机酸后，其对大肠杆菌O1和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径达到16.5mm和18.5mm，说明6126发酵上清液中除了有机酸外，还有其它的抑菌物质。2.2.2过氧化氢抑菌作用排除试验结果见表3。表3过氧化氢抑菌作用排除试验项目抑菌圈直径(mm)大肠杆菌O1金黄色葡萄球菌对照处理对照处理罗伊氏乳杆菌612615.015.517.017.0由结果可知，罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液(pH6.5～7.0)经过过氧化氢酶处理后的抑菌圈直径与对照相比变化不大，从而证明发酵液中的主要抑菌物质不是过氧化氢，还有另外的抑菌物质。2.2.3蛋白类抑菌物质的确定结果见表4。由结果可知，罗伊氏乳杆菌6126发酵液(pH6.5～7.0)经过几种蛋白酶处理后的抑菌圈直径尤其是金黄色葡萄球菌明显减少，胃蛋白酶和蛋白酶K的抑菌圈直径分别减少7.0%和6.8%，因此可以推断罗伊氏乳杆菌6126产生的抑菌物质中有蛋白类成分。因此，通过对罗伊氏乳杆菌发酵上清液进行酸性产物抑菌作用排除试验、过氧化氢抑菌作用排除试验及蛋白类抑菌物质的确定，可以说明罗伊氏乳杆菌6126在代谢过程中能够产生蛋白类抑菌物质——细菌素。2.3罗伊氏乳杆菌6126生长曲线及抑菌活性曲线的测定结果见图1。由结果可知，罗伊氏乳杆菌在4h左右度过延滞期，8h左右进入对数生长期，在24h左右活菌数达到最高，抑菌物质在4h开始产生，在对数期和稳定期产量持续增表4蛋白酶对罗伊氏乳杆菌6126发酵液中抑菌物质的影响指示菌大肠杆菌O1金黄色葡萄球菌对照处理对照处理胰蛋白酶17.016.024.523.5蛋白酶K17.016.216.215.2木瓜蛋白酶18.017.517.817.0胃蛋白酶18.017.017.216.0图1罗伊氏乳杆菌6126的生长曲线和抑菌活性曲线表5罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液对温度的敏感性抑菌圈及指示菌抑菌圈直径(mm)大肠杆菌O1金黄色葡萄球菌60℃CK18.220.410min18.020.030min17.320.060min18.220.380℃CK17.316.510min17.016.330min17.015.360min17.015.5100℃CK18.020.210min17.319.530min17.319.360min17.819.030加，在稳定期中期抑菌物质产量基本维持稳定。2.4罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液对温度及pH值的敏感性2.4.1对温度的敏感性结果见表5。由结果可以看出，罗伊氏乳杆菌6126的发酵上清液在60℃～100℃处理10min～60min，对大肠杆菌O1和金黄色葡萄球菌的抑菌效果非常明显，并且抑菌圈直径没有明显变化，说明6126的发酵上清液具有良好的热稳定性。2.4.2对pH值的敏感性结果见表6。表6罗伊氏乳杆菌6126发酵上清液对pH值的敏感性pH值大肠杆菌O1金黄色葡萄球菌2.015.015.73.015.516.04.016.616.25.016.318.26.016.017.57.016.418.58.015.618.29.016.016.810.013.816.0由结果可以看出，罗伊氏乳杆菌的发酵上清液在pH值2.0～10.0范围内，随pH值的升高，抑菌活性有所增强，并且pH值大于10.0时仍有非常明显的抑菌活性，这说明6126所产抑菌物质在酸性、中性及碱性条件下都具有较强的抑菌活性。3讨论乳酸菌代谢产生的许多物质如有机酸、过氧化氢和细菌素等都具有抑菌活性。在细菌素的研究中必须排除这