激光光镊技术

激光光镊技术04级医学实验金雅琼、王婉奕、刘雯、刘羽萱2007年3月28日一、基本概念z势阱：就是电子的势能图像类似一个波的形状，那么当电子处于波谷，就好像处在一口井里，比较稳定，很难跑出来。所以称为势井或势阱。不单单是量子力学里有这个势井，任何形式的势只要具有这种样子，我们都可以称它有势井/势阱。z三维势阱一、基本概念z光辐射压：当光照射到物体时,光子的动量传递给物体并产生压强,称为光压。光可以看作是光子流,每个光子都具有动量P:P=E/C=h/λE是波长为λ的光子能量。光压对于宏观物体的影响可以忽略不计,但对于直径小于100μm的微小粒子,这种辐射压的作用是必须考虑的。光具有能量和动量,携带动量的光与物质相互作用时会有动量的传递,从而表现为光对物体施加一力,并由此引起物体的位移和速度的改变,称之为光的力学效应。二、光镊的概念z光镊又称为单光束梯度力光阱(single-beamopticalgradientforcetrap),简单地说,就是用一束高度汇聚的激光形成的三维势阱来俘获、操纵控制微小粒子。三、历史（1969年）zAshkin通过理论计算认为聚焦的激光能推动尺寸为几个微米的粒子,并实现了用聚焦的氩离子激光使悬浮在水中的透明胶粒(直径0.6～2.5μm)沿着光轴方向加速推离。他发现接近光束的微粒也出乎意料地被吸入光束中推离。z在通过用气泡与液滴反复实验后,Ashkin认为光束对折射率比周围介质高的微粒具有横向吸力,但对折射率比周围介质低的微粒具有横向推力。三、历史（1970年）zAshkin等首先提出能利用光压(opticalpressure)操纵微小粒子的概念。三、历史（1986年）zAshkin才发现只需要一束高度聚焦的激光,就可以形成稳定的能量阱能将微粒稳定俘获。这标志着光镊的诞生,正因为如此,光镊的正式名称为单束光梯度力阱(single-beamopticalgradientforcetrap)。四、基本原理z（一）几何光学机制(Dλ时)z（二）瑞利机制(Dλ时)z（三）中间机制(介于前两者之间的情况)（一）几何光学机制z对Dλ的情况,俘获力的产生可通过光折射和动量守恒来分析。（图）z如果散射力和梯度力能够达到平衡,就能够实现对粒子的稳定俘获。z下面是由Ashkin给出的这些力的定量表达式：散射力：梯度力：（二）瑞利机制z光是电磁波,粒子(Dλ时)在光的电磁场中被极化成点偶极子(pointdipoles)z梯度力就是电磁波作用于偶极子上的洛伦兹力:（二）瑞利机制z光对粒子的散射力可如下表示:（二）瑞利机制z散射力和梯度力的合力指向光束焦点,将高介电常数的粒子向焦点方向推动,可以通过改变光束焦点的位置来操纵被俘获的粒子。z而光阱力又正比于光阱效率,故小球所受光阱恢复力在小球半径范围内大致正比于小球位移,即有F=-kx（二）瑞利机制z可见,粒子小球在光束焦点附近所受的力均指向光束焦点,由此可揭示在高度汇聚的光束焦点处存在指向焦点的势阱。（三）中间机制五、光镊特点z1、光镊的捕获和操控范围是数十nm到数十微米大小的微粒。而大多数生物微粒，诸如细胞、细胞器甚至生物大分子都在这一尺度范围内，光镊恰好成为这些生物微粒操控和研究的特有手段。五、光镊特点z2、由于光镊是用“无形”的光来实现对微粒非机械接触的捕获，捕获力是施加在整个微粒上，而不是像机械捕获那样集中在很小的面积上，因而不会对捕获的生物微粒产生机械损伤。五、光镊特点z3、选择粒子吸收小的光波长（600～1000nm）即可避免光吸收对生物粒子造成损伤。五、光镊特点z4、光镊的所有机械部件离捕获对象的距离都远大于捕获对象的尺度（1000倍），是“遥控”操作，因而几乎不干扰生物粒子周围环境和它的正常生命活动。五、光镊特点z5、利用光的穿透性，可以无损伤地穿过封闭系统的透明表层（如细胞膜）操控内部颗粒（细胞器），也可以穿过封闭的样品池的透明外壁，操控池内微粒，实现真正的无菌操作。这是常规生物仪器所不具备的。五、光镊特点z6、光镊对微粒的操控不是刚性的，可以在操作过程中实时测量微粒间的微小相互作用力。因此，光镊不但可以做为为机械手又可以用于生物粒子间微小作用力的测量，是生物微粒静态和动态力学特征的理想研究手段。这对生物大分子行为的研究具有特别重要的意义。六、激光光镊系统的结构和操作z本系统将激光技术，数字技术与显微成像系统结合，用激光作用微观物体，并将其捕获，变化过程通过显微成像系统再经CCD图像采集系统输入电脑。由电脑对微观过程进行后期处理。六、激光光镊系统的结构和操作z组成：本系统由半导体激光器（也可以是其他类型的连续或脉冲激光器），光学匹配元件，显微物镜，照明光源，二维精密载物台，电动快门，CCD摄像头，图像采集卡，计算机组成。基本构成z光镊系统通常由激光光源、激光扩束滤波光路、光镊移动控制环节、位移检测部分和传统的光学显微镜组成。基本构成六、激光光镊系统的结构和操作zQD(四相限光电探测器)作用：快速检测并记录小球的位移,其输出信号被电子放大器放大并送到光镊快速移动控制环节形成闭环反馈,以固定小球位置,并随时计算小球所受作用力的大小。z双色分光镜(D,dichoidfilter)将光镊光路与成像光路妥善耦合。六、激光光镊系统的结构和操作z光镊移动有光镊绝对移动和相对移动。z前者是移动光束以改变对粒子小球的光阱力,一般移动范围较小,不超过粒子半径。z后者是操控载物台上的样品池进行三维移动,使光镊对于样品做相对移动,移动范围稍大,一般在μm范围。六、激光光镊系统的结构和操作z控制环节包括电子驱动与计算机控制。z前者反馈放大电路;z后者包括光标引导的光镊与样品池的相对移动和位置记录。六、激光光镊系统的结构和操作z位移测量也按移动的不同分为2类:小球微位移测量;较大范围的相对位移测量。六、激光光镊系统的结构和操作光镊的校准和操控技术z1.位移标定z2.对力的标定z由于光镊的受力与位移有关,所以首先要对位移探测进行标定。不管是光镊绝对移动测量还是相对移动测量都需先对已知尺度如显微镜标尺进行测量,计算出测量量与标准尺度的转换系数。z被探测小球成像半径与CCD像素尺寸之比与探测精度有关。z该比值越小,探测误差越大。当比值大于50时,探测误差趋近于零。对力的标定分为对水平阱力和轴向阱力的标定。一般来讲,对光镊操作有影响的主要是水平阱力。对水平阱力的标定通常使用流体力学的方法,认为静止小球在一定流速流动的介质中或被光镊控制移动的小球在静止的介质中所受到的粘滞力可由Stokes公式计算:F=6πηrv。此力使小球偏离光阱中心位置,从而产生光阱恢复力。当粘滞力与光阱恢复力相等时小球的位置为平衡位置,测量此时的位移,可求出光阱的刚度。光镊技术的应用z（1）研究生物大分子的静态力学特性z（2）研究生物大分子的动力学特性z（3）对生物大分子进行精细操作z（4）分子水平上的特异性识别和生命过程的调控z（5）纳米生物器件的组装z（6）利用光镊操控微粒的功能z（7）nm光镊技术及其应用单光镊技术测量红细胞膜弹性新方法的建立z红细胞膜的弹性是红细胞的微观力学特征和全血流变学性质的基础,反映了红细胞变形通过毛细血管的能力和向组织器官输送氧气的能力,因此成为生物学、医学考察血液输氧能力的重要指标.实验准备：z细胞处理z小球处理z样品池处理z光镊操控力的标定测量：细胞膜弹性测量z首先将红细胞和小球悬浮液加入已被预处理底面固定有少量小球的样品池中.再用光镊操控一个细胞,使其一端粘在一个已固定于池底的小球上面,被锚定住.z然后,用光镊捕获一个悬浮的自由小球,将其粘在细胞直径的另一端;最后用一定功率的光镊操控粘在细胞可移动端的小球,向细胞外拖动.随着小球的移动,细胞也被拉长,当细胞被拉伸到一定长度时,细胞反弹并带动小球从光镊中逃逸,并最终回复初始的平衡状态.测量：细胞膜弹性测量z整个实验过程用计算机记录和显示.通过事先标定,可以从屏幕上测量被操控小球逃逸时相对于固定小球的距离,该距离减去细胞平衡状态时的直径D,即为细胞被拉后的伸长长度L,L/D为细胞相对伸长ε.用光镊操控小球的力F除以相对伸长ε,得到一个拉力2伸长比值:F/ε;逐步加大光镊操控力F,细胞相对伸长ε也加大,可得到一系列F/ε值,在每一次增加拉力之前,都使细胞恢复到平衡态(图2).用F对细胞相对伸长ε作图,可得一条拉力2伸长关系曲线（图1）.由曲线的线性部分斜率F/ε可以推算出红细胞的剪切弹性模量:光镊技术进展z1.纳米光镊技术：经过10余年的发展，光镊所能操控的对象的尺度延伸到了纳米量级。此外，光镊阱位或微粒的操控定位也3都达到了纳米精度。国外一些著名的大学和实验室都已经或计划开展利用光镊进行单个生物大分子的研究。国内中国科技大学激光生物实验室已研制了纳米光镊实验系统，并开展纳米生物学的研究。光镊技术进展z2.单光镊的时分复用：这种方法是在光镊光路中加入一个光学扫描部件，使单光镊一次反复在多个捕获位置间进行快速切换，每一个位置都按次序使用激光光源的一个时间片断。只要切换速度足够快，当光镊经过若干位置后，又重回到原来的位置，原先捕获的微粒还没有来得及脱离光镊捕获区域，又会重新稳定在原有捕获位置。这样就可以实现多隔微粒的操控，但不易进行复杂操作。光镊技术进展z3．多光镊系统：这种结构中每个光镊都由独立的光束形成。可以对某一激光束进行分束来得到多个光束，常用的有偏振分束法和干涉法。图3所示为干涉法产生多光镊结构示意图。光镊技术进展z4．光镊与其他技术的结合：光镊作为一种光学技术，很容易与其他光学技术结合在一起，并因而具有更完善的功能。光镊与光刀（激光微束）的结合就是典型例子，其中激光光镊用作光学微机械手，用来实现对微小“工件”的操控；而激光光刀则用作光学微刀具，实现对工件的显微加工切割、消融、穿孔。光镊技术进展z此外，提高光镊的效率和捕获功能也一直是人们努力的目标。为此，不同光场分布的光被用来形成光镊，例如空心光阱等。结语z总之，光镊技术是物理与生物两大基础学科的交叉，为新实验技术和方法与重大生物学基本问题的结合提供了极好的切入点，已经在生命科学若干基本问题的研究中发挥了重要的作用。作为带有前瞻性的基础研究方向，同时也必定会派生出各种实用的技术和方法，必将拥有一个广阔的发展前景。z作为一种纳米位移操纵手段和粒子间微小相互作用力（pN量级）的探针，它不仅仅用于生命科学领域，也同样适合于其他涉及微小粒子的研究和应用领域。THANKYOU!04级医学实验金雅琼、王婉奕、刘雯、刘羽萱2007年3月28日图1（a）图1（c）图1（b）z通过光镊D对单分子进行扭转、弯曲、拉伸等操作,研究其力学特性。例如:单个DNA分子在光镊拉力作用下的非线性弹性拉伸应变的实验研究,为研究单个DNA分子构型提供了进一步的实验基础。再如，用光镊测量了微管的刚度和驱动蛋白的扭转刚度。我们曾用光镊操控微球，使之粘附在血红细胞膜上，再用光镊拖拉小球，使红细胞形变，研究了红细胞与病变红细胞的形变特性。z光镊在生物大分子动力学特性研究中最重要的成果之一是动力原蛋白的研究，观察到了生命运动的原过程，发现分子马达是以步进方式运动，并且测量了其运动步长，单个驱动蛋白分子产生的力以及单个驱动蛋白的速度与ATP浓度的函数关系。人们还利用光镊研究了肌动蛋白丝与单个肌球蛋白分子间的相互作用，测量了没有ATP水解时单个肌球蛋白分子和肌动蛋白纤维分离时所需的力。单个分子运动试验引发了对运动详细模型、ATP水解环、单酶动力学的深入研究。z光镊由于径向尺寸很小,产生的势阱与分子布朗运动的能量相近,所以直接俘获长链大分子是很困难的。在分子链上接上一个玻璃或塑料小球作为“把手”,用光镊俘获小球,通过操作小球来操作大分子,这种方法很有效。日本学者在0.02μm宽、16μm长的单链DNA分子的两端粘上“把手”,利用双光束光镊成功地将DNA分子打上了结。这种方法有望用来解开遗传物质同细胞骨架的缠绕,为在分子水平了解生命的基本现象找到了一个新的途径。z利用光镊技术就可将被研究对象按设计组合配对,