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1激光扫描共聚焦显微镜技术在生物学中的应用2主要内容第一部分光学显微镜基础知识第二部分激光共聚焦显微镜技术第三部分图像改进技术（补充）3第一部分光学显微镜基础知识第一节发展历史第二节成像原理第三节主要技术主要技术参数参数第四节光学显微镜的基本组成结构第五节光学显微镜的调节第六节光学显微镜的使用与维护41590年，荷兰的眼镜制造者造出类似显微镜的放大仪器。1610前后，意大利的伽利略和德国的开普勒改变物镜和目镜之间的距离，得出合理的显微镜光路结构1665年虎克在显微镜中加入粗动和微动调焦机构、照明系统和承载标本片的工作台，这些部件经过不断改进，成为现代显微镜的基本组成部分。1673～1677年期间列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜1684年惠更斯制造出双透镜目镜：惠更斯目镜19世纪高质量消色差浸液物镜的出现，使显微镜观察微细结构的能力大为提高，19世纪70年代阿贝提出显微镜的完整理论1850年出现了偏光显微术；1893年出现了干涉显微术1902年艾夫斯建立了双目镜系统1935年泽尼克发现了相衬原理，并因此获得诺贝尔奖20世纪60年代微分干涉衬显微镜问世20世纪80年代共焦激光扫描显微镜开始应用主要的显微镜厂家主要有：奥林巴斯、蔡司、徕卡、尼康第一节光学显微镜的发展历史5光学显微镜的分类光学显微镜有多种分类方法：•按使用目镜的数目可分为双目和单目显微镜；•按图像是否有立体感可分为立体视觉和非立体视觉显微镜；•按观察对像可分为生物和金相显微镜等；•按光学原理可分为偏光、相衬和微差干涉相差显微镜等；•按光源类型可分为普通光、荧光、紫外光、红外光和激光显微镜等；•按接收器类型可分为目视、数码（摄像）显微镜等；•常用的显微镜有双目体视显微镜、偏光显微镜、荧光显微镜和激光显微镜等。6第二节显微镜的成像原理一、基本光学原理（一）折射和折射率光的折射现象折射率（反映介质的光学性质）n=sini/sinri是光线在真空中与法线之间的夹角．r是光线在介质中与法线之间的夹角（二）透镜的性能凸透镜可以会聚光线，凹透镜可以发散光线（三）凸透镜的五种成象规律二、显微镜成像（几何成像）原理物镜成象：利用物体在凸透镜一倍焦距以外二倍焦距以内，成倒立大的实象。目镜成象：是利用物体在凸透镜一倍焦距以内，成正立的放大的虚象。实像虚像7显微镜成像原理显微镜的成像原理示意图F1.物镜的前焦点F1/.物镜的后焦点F2.目镜的前焦点F2/.目镜的后焦点被观察的物体AB放在物镜的焦距以外、靠近焦点的地方,这样，在物镜的另一侧就生成一个放大、倒立的实像A′B′；这个实像正好落在目镜的焦距之内，目镜再将它放大一次，昀后生成一个倒立的虚像A〃B〃，供眼睛观察。由此可见，物体被显微镜的光学系统作了两次放大。8第三节显微镜显微镜的主要技术参数的主要技术参数一．一．数值孔径数值孔径二．二．分辨率分辨率三．三．放大率放大率四．四．焦深焦深五．视场直径六六..覆盖差覆盖差七七..工作距离工作距离八.同焦距九.同轴度9一、数值孔径一、数值孔径NumericalAperture(NA)数值孔径NumericalAperture(NA)简写NA，是衡量物镜或聚光镜性能高低的重要指标（尤其对物镜而言）。其数值的大小，分别标刻在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径NumericalAperture(NA)是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（n）和孔径角（u）半数的正弦之乘积。用公式表示如下：NA=nsinu/2。目前市面上出售的物镜，干镜的数值孔径最大可达0.95，水镜的数值孔径最大可达1.2，油镜数值孔径可达1.45数值孔径与其他技术参数有着密切的关系。与分辨率成正比，与放大率成正比，与焦深成反比，NA值增大，视场宽度与工作距离都会相应地变小。10（一）分辨率：是衡量显微镜性能的一个重要技术参数。往往用最小分辨距离来表示。在显微镜的设计中确定，当最小点的衍射斑象的中心刚好落在另一个衍射斑象的边缘，则认为两物点象刚刚能够被分辨；这就是可以分辨的最小距离计算公式：σ=λ/NA（λ为照射光波长，NA为显微镜物镜的数值孔径）二、分辨率二、分辨率ResolutionResolution（二）物镜的数值孔径越大，点光源像的AiryDisk就越小，物镜的分辨率也越高(σ=λ/NA)（三）.几个重要的分辨率人眼：0.2mm光学显微镜：0.2um（在紫外光单色光照明情况下）电子显微镜：0.2nm11三、放大率三、放大率（Magnification）总放大率M=Mob（物镜放大率）×Moc（目镜放大率）•Mob=△/F1(△为标准镜筒长度160毫米；F1为物镜的焦距)•Moc=250/F2(250为人的明视距离，单位为毫米,F2为目镜的焦距)四、焦深（DepthofFocus)焦深为焦点深度的简称，即在使用显微镜时，当焦点对准某一物体时，不仅位于该点平面上的各点都可以看清楚，而且在此平面的上下一定厚度内，也能看得清楚，这个清楚部分的厚度就是焦深。焦深大,可以看到被检物体的全层；而焦深小，则只能看到被检物体的一薄层焦深与其他技术参数有以下关系：（1）焦深与总放大倍数及物镜的数值孔径成反比。（2）焦深大，分辨率降低。（3）焦深计算公式：D=K.η/M.NA其中，K：常数为240微米，η：被检物体周围的折射率M：总放大率，NA：物镜的数值孔径12视域直径也称视域宽度，是指在显微镜下看到的圆形视场内所能容纳被检物体的实际范围，视域直径越大，越便于观察。计算方法：φ=FN/Mob，φ：视域直径；Mob：物镜放大率FN：视域直径数fieldofviewnumber，是目镜的固定参数，标刻在目镜的外面；视域直径数（fieldofviewnumber,F.N.)是反映目镜能观察到的昀大的视场直径。越大，则可在同一视野内看到更多的范围。如下图所示。目前OLYMPUS标准套的目镜视场数为22，26.5则为超宽视场的目镜五、视域直径（FieldOfView）标本的视场直径标本的视场直径==目镜视域直径数目镜视域直径数//物镜倍率物镜倍率例例:WH10X:WH10X目镜视场数为目镜视场数为2222，物镜为，物镜为UPLFL40XUPLFL40X标本的视场直径标本的视场直径=22=22÷÷40=0.55mm40=0.55mm13六、覆盖差带校正环的40倍物镜盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm•显微镜的光学系统也包括盖玻片在内。由于盖玻片的厚度不标准，光线从盖玻片进入空气产生折射后的光路发生了改变，从而产生了相差，这就是覆盖差。覆盖差的产生影响了显微镜的成响质量。•国际上规定，盖玻片的标准厚度为0.17mm，许可范围在0.16-0.18mm，在物镜的制造上已将此厚度范围的相差计算在内。物镜外壳上标的0.17，即表明该物镜所要求的盖玻片的厚度。•校正物镜上带有校正环，可以校正不同厚度盖玻片引起的覆盖差，如此物镜可校正0.11~0.23范围。七、工作距离七、工作距离((W.DW.D))•工作距离（缩写W.D.）也叫物距：物镜前透镜表面到标本之间的距离。镜检时，被检物体应处在物镜的一倍至二倍焦距之间。因此，它与焦距是两个概念，平时习惯所说的调焦，实际上是调节工作距离。•数值孔径大的高倍物镜，其工作距离小。•由于物镜有工作距离的限制，在观察不同标本的时候就要注意物镜的工作距离。比如，观察培养瓶内底部的细胞时，由于正置显微镜的物镜工作距离不够，就需要用倒置显微镜从底部向上观察。14八.同焦距（齐焦距离)同焦距（齐焦距离)同焦距（Parfocality)即不同倍率的物镜之间保证相同的焦距。使用中表现为，不同倍率之间转换物镜时，焦距应该不会偏离很多。现在新的光学系统中，大部分都可以保证比较好的同焦距，不会出现转换倍率后焦距差异很大的情况。九.同轴度同轴度同轴度是指不同倍率的物镜之间中心的重合程度，使用中表现为不同倍率转换时，中心的图象不会偏离太远（在误差允许范围内）。如果出现转换物镜后，中心严重偏离则是同轴度不合格。15第四节光学显微镜的组成结构光学显微镜包括光学系统和机械装置两大部分机械装置机架：显微镜的主体部分，包括底座和镜臂。目镜筒：靠环形燕尾槽与机架固定，目镜插在其上。载物台：是放置玻片的平台，其中央具有通光孔。台上有一个弹性的标本夹，用来夹住载玻片。右下方有移动手柄，使载物台面可在XY双方向进行移动。调焦机构：利用调焦手轮可以驱动调焦机构，使载作粗调和微调的升降运动，从而使被观察的样品细节成像调焦清晰。物镜转换器：它是一个旋转圆盘，上有3～6个孔，分别装有低倍或高倍物镜，转动物镜转换器就可不同倍率的物镜进入工作光路。聚光器调节机构：聚光器安装在其上，用于调节光路。16光源有卤素灯、钨丝灯、汞灯、金属卤化物(气体放电)灯等。二二..目目镜镜一.光源光学系统通常目镜由上下两组透镜组成，上面的透镜叫做接目透镜，下面的透镜叫做会聚透镜或场镜。目镜是将已被物镜放大的，分辨清晰的实像进一步放大，达到人眼能容易分辨清楚的程度。只是起放大作用，并不提高分辨率。因此，不推荐使用高倍的目镜来提高整个放大倍率。常用目镜的放大倍数有5—16倍；按照所能看到的视场大小，目镜可分为视场较小的普通目镜，和视场较大的大视场目镜(或称广角目镜)两类。目镜（Eyepiece）是显微镜中一个重要的光学部件，靠近观察者的眼睛，因此也叫接目镜。安装在镜目筒的顶部。较高档显微镜的目镜上还装有屈光度调节机构(即在接目镜的外框上分别印上“＋”、“－”刻度标记)，操作者可以方便快捷地对左右眼分别进行“屈光度”调节。17基础知识眼点又称目镜的出射点，目前的显微镜大都采用高眼点的目镜。观察者可以不必贴在目镜前，就能看到整个视场的图象。可以戴眼镜观察。视域直径数（前述）此外，在这些目镜上可以加装测微尺，测微尺的象总能清晰地调焦在标本的焦面上三.聚光器（Condenser)聚光器主要由聚光镜和孔径光阑组成聚光镜是一个重要的光学部件。无论在镜检和显微摄影中都发挥着重要的作用。起着汇聚照明光线到标本上，提供昀强的照明光线。聚光镜的的结构有多种，同时根据物镜数值孔径的大小，相应地对聚光镜的要求也不同。181．阿贝聚光镜（Abbecondenser）这是由德国光学大师恩斯特.阿贝(ErnstAbbe)设计。阿贝聚光镜由两片透镜组成，有较好的聚光能力，但是在物镜数值孔径高于0.60时，则色差，球差就显示出来。因此，多用于普通显微镜上。2．消色差－消球差聚光镜(Achromaticaplanaticcondenser)这种聚光镜又名“消球差聚光镜”和“齐明聚光镜”，它由一系列透镜组成，它对色差、球差的校正程度很高，是明场镜检中质量昀高的一种聚光镜，其NA值达1.4。因此，在高级研究显微镜常配有此种聚光镜。它不适用于4X以下的低倍物镜，否则照明光源不能充满整个视场。3．摇出式聚光镜（Swingoutcondenser：摆进－摆出式前端透镜）在使用低倍物镜时（如4X），由于视场大，光源所形成的光锥不能充满真整个视场，造成视场边缘部分黑暗，只中央部分被照亮。要使视场充满照明，就需将聚光镜的上透镜从光路中摇出。4．其它聚光镜聚光镜除上述明场使用的类型外，还有作特殊用途的聚光镜。如暗视场聚光镜，相差聚光镜（PH），微分干涉聚光镜(DIC)等，以上聚光镜分别适用于相应的显微镜检观察方式。19四、四、物物镜镜基础知识物镜为显微镜中昀重要的光学部件，是整个显微镜中价值昀重的部分。同样一个机架，安装不同档次的物镜，观察效果是完全不同的。当然价格也会完全不同，所以选择显微镜时要注意所配物镜的档次。（一）镜头的性质20镜头的性质每个物镜上都标记有物镜的放大倍数，如：10x、20x等等。有的物镜还用一条彩色的环线来标记物镜的放大倍数。数值孔径是物镜昀重要的参数之一，数值孔径是对物镜集光能力的度量。数值孔径的可以从低放大倍数物镜的0.04到高放大倍数平场复消色差油镜的1.4。如果物镜被设计为在其前透镜和标本之间使用油作为浸没介质，在物镜上就会标明Oil，表示是油镜；如果没有标明，就是干镜；如果标