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提问：植物细胞工程常用的技术手段有哪些？•植物组织培养,植物体细胞杂交这些技术的理论基础：植物细胞的全能性动物细胞全能性如何？二、动物细胞工程•常用技术•动物细胞培养•动物细胞融合•单克隆抗体•胚胎移植•核移植动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础。(一）动物细胞培养阅读第70页：动物细胞培养，思考回答下列问题：（1）动物细胞培养液成分？（2）动物细胞培养过程？（3）原代培养与传代培养、细胞株与细胞系的区别？（4）动物细胞培养的应用？观看示意图简述融合过程？2、诱导动物细胞融合的方法3、动物细胞融合的用途制备单克隆抗体：仙台病毒紫外线丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）物理法化学法生物法•思考：（1）请概括单克隆抗体的概念（2）根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国科学家柯勒设计的实验方案，思考实验过程与原理？（3）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？制备过程为何要经过两次筛选？(三)单克隆抗体提出问题：长期以来，人们为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。1.概括单克隆抗体的概念单：单个细胞克隆:无性繁殖抗体:化学性质单一、特异性强•实验目的:制备单克隆抗体.•实验原理：•实验材料：小白鼠•实验器材：培养皿、针筒等等。•实验过程：？2.根据阿根廷科学家米尔斯坦和德国科学家柯勒设计的实验方案，回答下列问题：B淋巴细胞能产生抗体，骨髓瘤细胞能无限增殖，杂交瘤细胞既能产生抗体又能无限增殖。（1）为什么用小鼠骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合？思考：（2）单克隆抗体制备过程中应用哪些细胞工程技术手段？（3）制备过程为何要经过两次筛选？单克隆抗体的制备抗原小鼠B淋巴细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞细胞融合，筛选细胞培养筛选，继续培养体外培养体内培养单克隆抗体单克隆抗体有何应用？主要用于疾病的诊断、治疗和预防。与常规抗体相比，具有特异性强、灵敏度高的优点。如；各种癌症、肝炎病毒、SARS病毒、细菌及血吸虫等数百种疾病的诊断；在疾病治疗方面，单克隆抗体犹如人体卫士，能识别“自己”与“异己”，一旦发现致病因素便与之结合将其杀死。若在单抗上带上抗癌药物制成“生物导弹”，将药物定向带到癌细胞所在部位，既消灭了癌细胞又不会伤害健康细胞。绝大多数的单克隆抗体(mAb)是用小鼠开发的，虽然可作为研究和诊断的工具，但它们至少在一定程度上不是理想的治疗剂，：因为它们在人类中有免疫原性。也就是说，小鼠抗体引入到病人体内，将被病人的免疫系统识别为外源物质，并将发生有损治疗抗体利用的人抗鼠抗体(HAMA)应答。已经通过将这些鼠的抗体人源化或直接制备人的mAb来解决。直接制备人的mAb通过人的B细胞与骨髓瘤细胞融合，已经制成了人的抗体，虽然这曾是十分困难的，并且通常在融合前需要用EB病毒感染以无限增殖B细胞。这种方法由于使用病毒而不理想，产生的mAb的特异性是有限的，抗体的产量也很少。最近，通过用人免疫球蛋白基因取代小鼠免疫球蛋白基因创建了产生人抗体的小鼠。因此，当小鼠被免疫时它直接制造出对该抗原的人的抗体，并且产生这些抗体的B细胞可与骨髓瘤细胞融合，产生制造人mAb的杂交瘤。•因为B淋巴细胞具有分泌特异性抗体的能力，而骨髓瘤细胞具有在体外培养条件下大量增殖的本领，所以由某种B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合产生的杂交瘤细胞，能够在体外大量繁殖，并且产生特定的单克隆抗体。细胞融合技术、细胞培养技术。•第一次筛选得到杂交瘤细胞，第二次筛选先在多孔培养板上，在每孔只有一个杂交瘤细胞下培养筛选出特异抗体的细胞群。动物细胞培养液的主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。与植物培养基相比其特点是：（1）液体培养基（2）含有动物血清动物体细胞大都生活在液体的环境保证细胞顺利的生长增殖动物细胞培养•胚胎或幼龄动物的组织器官细胞悬浮液10代细胞50细胞无限传代剪碎胰蛋白酶洗涤、稀释、分离原代培养用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。动物细胞培养不能最终培养成生物体传代培养细胞株细胞系动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。细胞悬浮液10代细胞50代细胞无限传代原代培养传代培养细胞株细胞系如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？多数组织细胞固定在表面生长和分裂。随细胞增多，细胞就会停止分裂增殖遗传物质改变动物细胞培养技术的应用•（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。•（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。•（3）用于检测有毒物质•（4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据这只老鼠身上的“人耳”是由我国科学家曹谊林教授利用细胞工程技术复制出来的。拓展：聚乙二醇处理后，培养液中存在哪几种细胞？脾-脾脾-瘤瘤-瘤未融合的脾细胞未融合的瘤细胞•已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断，人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂交瘤细胞，请回答：（1）试管中除融合的杂交瘤细胞外，还有_____________种融合细胞。（2）设计一方法（不考虑机械方法），从培养液中分离出杂交瘤细胞，并说明原理。方法：原理：试试身手解析：（1）试管中有人的淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞，在促溶剂的作用下，可能出现以下3种细胞的融合情况，人的淋巴细胞和淋巴细胞融合，小鼠的骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞融合，人的淋巴细胞和小鼠的骨髓瘤细胞融合，实验需要的是第3种细胞，即杂交瘤细胞；（2）要将杂交瘤细胞分离出来，可以在培养液中加入氨基嘌呤，收集增殖的细胞；加入氨基嘌呤后，使D合成途径阻断，仅有D合成途径的骨髓瘤细胞及其彼此融合的细胞就不能增殖，但人淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后的杂种细胞中可以利用淋巴细胞中的S途径合成DNA而增殖。•变式训练生产单克隆抗体时，要在培养液中加入某种试剂才能筛选出杂交瘤细胞，因为该试剂A．能抑制淋巴细胞和杂交瘤细胞的DNA复制B．能阻止淋巴细胞的原癌基因被激活C．选择性抑制骨髓瘤细胞的DNA复制D．能阻止杂交瘤细胞核糖体上所有蛋白质的合成（3）将分离出的杂种细胞在不同的条件下继续培养，获得A、B、C三细胞株，各细胞株内含有的人染色体如下表所示（“＋”有，“－”无）细胞株人染色体编号12345678A株＋＋＋＋－－－－B株＋＋－－＋＋－－C株＋－＋－＋－＋－•测定各细胞株内人体所具有的5种酶的活性，结果是：①B株有a酶活性；②A、B、C株均有b酶活性；③A、B株有c酶活性；④c株有d酶活性；⑤A、B、C株均无e酶活性。若人基因的作用不受鼠基因影响，则支配a、b、c、d和e酶合成的基因依次位于人的______、_______、_______、_______和_______号染色体上。解析：（3）B株有a酶活性，通过表格可以看出B株有6号染色体而A、C株没有，说明控制a酶活性的基因位于6号染色体上。控制其它酶的基因所在的染色体位置以此类推。答案：6；1；2；7；8。获得细胞细胞的全能性细胞株、细胞系植物体培养结果或细胞产物快速繁殖、培育无病毒植株等培养目的葡萄糖、动物血清蔗糖、植物激素培养基特有成分液体培养基固体培养基培养基性质细胞增殖原理动物细胞培养植物组织培养比较项目主要用于制备单克隆抗体获得杂种植株用途物理、化学方法（同左）灭活的病毒物理（离心、振荡、电刺激）化学（聚乙二醇）诱导方法使细胞分散后诱导细胞融合去除细胞壁后诱导原生质体融合细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性细胞融合的原理动物细胞融合植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较卵细胞C母绵羊子宫Ａ母绵羊Ｂ母绵羊乳腺细胞细胞质细胞核细胞核移植胚胎移植早期胚胎多莉羊分娩卵裂融合后的卵细胞细胞拆合技术妊娠多莉羊的培育过程细胞核移植采用此方法可以将两个不同种、属的动物优点集中在一起，产生具有双亲优点的可繁殖的杂种动物。细胞核移植对动物优良杂交种的无性繁殖具有重大意义。这一技术的成功与完善对于优良家禽的无性繁殖和濒临绝迹的珍贵动物的传种意义重大。三、动物细胞工程(一).动物细胞培养(二).动物细胞融合(三).单克隆抗体(四).细胞核、胚胎移植总结：①植物组织培养是植物细胞工程技术的基础。②动物细胞培养是各种动物细胞工程技术的基础。③为达到特定的目的，许多细胞工程技术往往需要同时运用。