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植物组织培养技术PlantTissueCulture一、实验目的二、相关知识三、实验原理四、试剂和器材五、操作步骤六、思考题目录2020/6/133一、实验目的☆掌握植物组织培养相关理论知识☆掌握植物组织培养的操作方法☆了解不同激素及其比例对愈伤组织再分化的作用2020/6/134二、相关知识离体（invitro)条件下利用人工培养条件在无菌情况下培养、生长、发育再生出完整植株的过程。1958年，英国科学家Steward等用胡萝卜根的愈伤组织细胞进行悬浮培养，成功诱导出胚状体并分化为完整的小植株，不但使细胞全能性理论得到证实，而且为组织培养的技术程序奠定了基础。2020/6/135应用领域1、快速繁殖运用组织培养的途径，一个单株一年可以繁殖几万到几百万个植株。例如一株兰花一年繁殖到400万株。2、种苗脱毒针对病毒对农作物造成的严重危害，通过组织培养可以有效地培育出大量的无病毒种苗。3、远缘杂交利用组织培养可以使难度很大的远缘杂交取得成功，从而育成一些罕见的新物种。二、相关知识2020/6/136应用领域4、突变育种采用组织培养可以直接诱变和筛选出具抗病、抗盐、高赖氨酸、高蛋白等优良性状的品种。5、基因工程基因工程主要研究DNA的转导，而基因转导后必须通过组织培养途径才能实现植株再生。6、生物制品有些极其昂贵的生物制品，如抗癌首选药物--紫杉醇等，可通过组织培养方式生产。二、相关知识2020/6/137植物组织培养的分类广义的组织培养依外植体不同，可分为：1)器官培养（organculture）2)茎尖分生组织培养(shoottipculture,apicalmeristemculture)3)愈伤组织培养(callusecultrue)4)细胞培养(cellculture)5)原生质体培养(protoplastculture)二、相关知识2020/6/138外植体(explant)：由活体（invivo)植物体上提取下来的，接种在培养基上的无菌细胞、组织、器官等。愈伤组织(callus)：在人工培养基上由外植体上形成的一团无序生长状态的薄壁细胞。二、相关知识2020/6/139二、相关知识2020/6/1310二、相关知识2020/6/1311二、相关知识2020/6/1312二、相关知识2020/6/1313二、相关知识二、相关知识2020/6/1315植物组织培养特点①培养条件可以人为控制②生长周期短，繁殖率高③管理方便，利于工厂化生产和自动化控制二、相关知识2020/6/1316植物组织培养营养条件-培养基(CultureMedium)培养基是植物组织培养的重要基质。培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。二、相关知识2020/6/1317国际上流行的培养基有几十种，常用的培养基有：MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基、KM-8P培养基二、相关知识2020/6/1318常用培养基简介--MS培养基1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。二、相关知识2020/6/1319常用培养基简介--B5培养基是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。二、相关知识2020/6/1320常用培养基简介--White培养基是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。其特点是无机机盐数量较低，适于生根培养。二、相关知识2020/6/1321常用培养基简介—N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。二、相关知识2020/6/1322常用培养基简介—KM-8P培养基1962年由Murashige和Skoog为培养烟草细胞而设计的。特点是无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液。其养分的数量和比例较合适，可满足植物的营养和生理需要。它的硝酸盐含量较其他培养基为高，广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。有些培养基是由它演变而来的。二、相关知识2020/6/1323不同营养条件对植物组织培养的影响GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceVeryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.Theresultiscomparablewiththecontrolmedium二、相关知识NoBAPBAPreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant二、相关知识NAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.MSsaltsreducedto0.47g.l-1SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus.二、相关知识2020/6/1326植物细胞的全能性植物细胞具有该植物体全部遗传的可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。差异:(1)受精卵的全能性最高(2)受精卵分化后的细胞中，体细胞的全能性比生殖细胞的低。潜在全能性的原因：基因表达的选择性科学研究表明，处于离体状态的植物活细胞，在一定的营养物质、激素和其他外界条件的作用下，就可能表现出全能性，发育成完整的植株。人工条件下实现的这一过程，就是植物组织培养。三、实验原理2020/6/1327植物细胞全能性的表达脱分化（dedifferentiation)：将来自已分化组织的已停止分裂的细胞从植物体部分的抑制性影响下解脱出来，恢复细胞的分裂活性。再分化（redifferentiation):经脱分化的组织或细胞在一定的培养条件下可有转变为各种不同细胞类型的能力。三、实验原理2020/6/1328四、试剂和器材1、材料新鲜胡萝卜茎2、试剂MS培养基10%亚硫酸溶液2020/6/1329MS培养基配制方法四、试剂和器材2020/6/1330四、试剂和器材3、仪器高压灭菌锅、超净工作台、烘箱、培养箱4、玻璃器皿试剂瓶(50、100、1000ml)、三角瓶(100ml)、刻度吸管(0.5、1、5、10ml)、培养皿5、用具镊子、解剖刀、接种针、记号笔、封口膜2020/6/1331离体的植物器官、组织、细胞脱分化愈伤组织再分化根芽植物体五、操作步骤①切开胡萝卜，在圆圈处取一块组织P-木质部、C-形成层、X-韧皮部五、操作步骤②形成层开始形成愈伤组织C1-愈伤组织、C2-形成层五、操作步骤③3-4周后完全形成愈伤组织状态（脱分化）组织块失去色素五、操作步骤④把脱分化后的愈伤组织转移到培养基上五、操作步骤⑤两周左右开始再分化，长出幼苗五、操作步骤⑥将幼苗移植到外部条件下培养（顺化）五、操作步骤⑦顺化一个月后的胡萝卜植株五、操作步骤培养基配制(I)—母液配制：按照MS培养基成分表,配制分别配制培养基的母液。1、大量元素母液(10倍液)分别称取10倍用量的各种大量无机盐，依次溶解于大约800ml热的（60-80℃）蒸馏水中。（一种成分完全溶解后再加入下一种，最后加水，定容至1000ml后装入试剂瓶中，冰箱内贮存备用）。五、操作步骤2、微量元素母液(100倍液)分别称取100倍用量的微量无机盐，依次溶解于800ml重蒸水中，加水定溶到1000ml。3、铁盐母液（100倍液）称取100倍用量的Na2-EDTA(乙二胺四乙酸钠)和FeSO4·7H2O，溶于800ml重蒸水中，最后定容到1000ml。五、操作步骤培养基配制(I)—母液配制：4、有机物质母液(100倍数)分别称取50倍用量的各种有机物质，依次溶解于400ml重蒸水中，定容至1000ml，装入棕色试剂瓶中，贮存冰箱备用。除上述四种母液外，培养基中经常附加的各种生物素和细胞分裂素也要配成母液贮存，临用时按浓度定量吸取加入。五、操作步骤培养基配制(I)—母液配制：5、生长素如2,4-D、IAA、NAA等。准确称取20mg，先用2ml95%乙醇溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。6、细胞分裂素如激动素(Kt)、6-苄基嘌呤(6-BA)。准确称取20mg，先用2ml的1mol/mlHCL或NaOH溶解，然后加水，定容至20ml，浓度为1mg/ml，再放置冰箱内贮存备用。五、操作步骤培养基配制(I)—母液配制：取1000ml烧杯一只，加大量元素10倍母液100ml，微量元素100倍母液10ml，铁盐100倍母液10ml,有机物质100倍母液10ml。此外,根据培养材料和实验目的还要附加一定量的生长素,细胞分裂素及蔗糖等,然后加水至1000ml,待蔗糖充分溶解后用1mol/L的NaOH或HCl调酸碱度为pH5.8,最后加入琼脂粉6.5g,如用琼脂条,则要加8g。五、操作步骤培养基配制(II)—配制与分装：将盛有培养基的烧杯在电磁炉上，煮至琼脂完全融化，补加蒸馏水至1000ml。将配制好的培养基分装到培养用三角瓶中，每只100ml三角瓶约装40ml培养基。分装时要避免把培养基倒在瓶口上，否则培养时容易引起杂菌污染。五、操作步骤培养基配制(II)—配制与分装：1、把装好的培养基的三角瓶放入高压灭菌锅中，盖好锅盖。2、设置灭菌参数为121℃，20min，开始灭菌。五、操作步骤培养基配制(III)—灭菌：1、取新鲜胡萝卜茎，用去离子水洗净。2、在胡萝卜茎上切一块含有形成层的组织，放入磨口三角瓶中，倒入适量10%亚硫酸溶液，轻轻摇动15-30s。3、倒去亚硫酸溶液，无菌水洗涤3-4次，彻底清除