annexinV-FITC(FL1通道)+PI(FL2通道)双染细胞,FITC阳性+PI阴性细胞百%就是早期凋亡%。一、原理磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)正常位于细胞膜的内侧,但在细胞凋亡的早期,PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中。AnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与PS高亲和力特异性结合。将AnnexinV进行荧光素(FITC、PE)或Biotin标记,以标记了的AnnexinV作为荧光探针,利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但在凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将AnnexinV与PI匹配使用,就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。二、方法1、调整待检测细胞浓度为106个/ml,取200ul,1000rpm×5min(4℃)。2、预冷的PBS1ml润洗两次2,1000rpm×5min(4℃)。3、将细胞重悬于100ulbindingbuffer,加入2ulAnnexin-V-FITC(20ug/ml),轻轻混匀,避光冰上放置15分钟。4、转至流式检测管,加入400ulPBS,每个样品临上机前加入1ulPI(50ug/ml),2分钟后迅速检测。5、同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。三、注意事项1、整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞。2、操作时注意避光,反应完毕后尽快在一小时内检测四、结果判定以AnnexinV为横轴,PI为纵轴;左上象限为机械性损伤细胞;右上为晚期凋亡细胞或者坏死细胞;左下为阴性正常细胞;右下为早期凋亡细胞。