搜索
应用双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母GS115中的表达量姓名：夏永仙学号：3110102专业：微生物日期：2011-12-41.毕赤酵母表达系统优点1.含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达2.表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化3.发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/L以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000L4.培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖5.外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失6.作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能2.概括内容：通过同源重组的方式分别在毕赤酵母基因组HIS4位点与AOX1位点整合pPIC9K和pPICZαB，实现在同一宿主菌中的共表达，从而提高标蛋白在毕赤酵母中的基因剂量，在一定范围内以提高目标蛋白的表达量表达载体主要分类(1)胞内表达载体主要有pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)，等。该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以避免毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖基化相关基因的表达。(2)分泌型表达载体主要有pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P等。由于毕赤酵母本身的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及积累。毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式通过转化DNA与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母可产生稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有HIS4基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载体经限制性内切线性化以后，可在AOX1或his4位点进行同源重组，从而产生HIS+重组子。1）基因插入AOX1或aox1::AGR4位点2）基因插入His4位点3）多拷贝插入表达载体如pPIC9K，pPIC3.5K3.实验方法及结果1)酵母表达载体pPICZαB-ggh的构建pPIC9K-ggh带有KpnⅠ和NotⅠ两种酶切位点的GGH引物ggh基因pMD19-TSimpleVectorE.coliJM109验证抽提质粒KpnⅠ和NotⅠpPICZαBpPICZαB-ggh双酶切E.coliJM109转化筛选阳性克隆PCR双酶切鉴定2000bp左右的DNA片段连连3.实验方法及结果2)重组表达质粒的线性化和电转化酵母细胞5~10μgpPICZαB-gghPmeⅠ线性化5.6kb片段回收−20℃保存备用电转化Bio-Rad电转仪涂布培养30℃2~3d出现转化子3.实验方法及结果3)免疫斑点法筛选高表达菌株①将菌落转移到醋酸纤维素薄膜上②在BMMY平板上置同样大小的0.22μm的硝酸纤维素薄膜，将醋酸纤维素薄膜菌落面向上置于硝酸纤维素薄膜上，30℃培养80h，上层醋酸纤维素薄膜转移至MD平板上，4℃保存③下层硝酸纤维素薄膜取出，5％脱脂奶封闭2h，用TBST洗膜5min，重复3次。用兔抗人血清白蛋白多抗37℃孵育2h，用TBST洗膜5min，重复3次。用二抗结合，37℃孵育2h，用TBST洗膜5min，重复3次。加入新鲜配置的DAB显色液，染色5min后用TBST清洗，挑选出染色颜色较深的菌落进行摇瓶培养和诱导。3.实验方法及结果4)诱导表达及表达产物分析挑取膜上颜色由深到浅的单菌落接种于10mL的YPD培养基，培养24h，5％接种量转接到装有60mL含3％甘油的BMGY培养基的500mL三角瓶中，初始OD600为1，30℃、120r/min振荡，24h后离心收集菌体，用20mL含有3％甲醇的BMMY培养基重悬菌体后诱导表达，甲醇诱导80h后OD600约为200，10000r/min离心10min，收集上清，用尿微量白蛋白试剂盒测发酵上清液中的目的蛋白含量，发酵液离心后取上清等体积进行SDS-PAGE分析3.实验方法及结果4)诱导表达及表达产物分析GS115/F3GS115/F33.实验方法及结果5)重组毕赤酵母基因组的提取和PCR鉴定阳性克隆提取高产菌GS115/F3和出发菌株GS115/F2的基因组DNA，加入RNaseA消除RNA的干扰。以pPICZαB质粒上的抗性基因，即Zeocin基因为扩增目的片段设计引物对提取的酵母基因组DNA进行PCR扩增验证3.实验方法及结果6)Q-PCR鉴定高产菌的目的基因拷贝数设计基因gapdh、ggh片段引物PCR回收基因片段pMD19-T质粒重组质粒E.coliJM109转化验证并提取重组质粒建立gapdh基因和ggh基因的循环数(Ct值)与起始模板数的相关标准曲线检测待测样品中的ggh基因表达水平的差异F3与F2相比：基因剂量提高了26.7％蛋白产量提高了49.7％3.实验方法及结果6)Westernblotting鉴定融合蛋白的表达将原始出发菌株GS115/F2和高产菌株GS115/F3的发酵液离心取上清，200V电压下进行SDS-PAGE电泳，100V电压下转膜60min至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉4℃封闭过夜，TBST洗膜3次，分别加入鼠抗人血清白蛋白单抗和鼠抗人GLP-1单抗结合(抗体均以1∶1000稀释)，37℃孵育2h，去除抗体，TBST洗膜3次。再加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠的二抗(1∶1000稀释)，37℃下孵育2h，去除二抗，TBST洗膜3次之后，加DAB显色。3.实验方法及结果6)Westernblotting鉴定融合蛋白的表达表达宿主经双质粒体系改造前后蛋白质的分子量均是7.3kDa，表明宿主菌株的改造没有影响融合蛋白的特性融合蛋GGH同时具有人白蛋白和人胰高血糖素样肽-1的免疫原性GGH降解条带4.讨论1）将免疫斑点法结合高浓度抗生素平板对其进行筛选，抗生素平板上生长的菌落影印在醋酸纤维素薄膜上，诱导分泌的蛋白透过醋酸纤维素膜结合在硝酸纤维素膜上。免疫显色后各菌落的外泌蛋白量之间的对比明显、直观，可以直接挑选染色较深的单菌落进行液体培养基诱导表达。这个方法简化了筛选高产菌株的工作量，并且可靠性更高。但是高浓度的抗生素抗性在很多情况并不能真实反映表达量，某些拷贝在整合时目的基因可能丢失，仅剩下抗生素抗性，出现假阳性。免疫斑点法筛选的特点是必须应用已知蛋白的相应抗体进行筛选，因此，对于尚无抗体的新蛋白或者比较昂贵的抗体应用较难。4.讨论2）毕赤酵母中宿主表型、基因剂量、外源基因特性、外源蛋白的理化性质和发酵条件的优化控制等都是影响蛋白质表达水平的重要因素。一般提高基因剂量的方法大部分都是通过在体外构建多拷贝的目的基因串联以同源重组的方式整合到酵母基因组中，然后通过高浓度的抗生素来筛选高表达的转化子。本研究证明了两次电转携带有同种目的基因的不同分泌型表达质粒，通过高浓度的抗生素结合免疫法筛选，不仅可以提高目的基因的拷贝数，并且在一定范围内提高了外源蛋白的表达量。这种双质粒共表达体系不仅可以提高单一蛋白在宿主中的表达量，还可以实现两种不同的蛋白在同一宿主中的共表达。4.讨论3）本实验通过建立双质粒共表达体系提高融合蛋白GGH在毕赤酵母中的表达，然后通过高浓度的抗生素抗性结合免疫斑点法进行高通量的筛选，获得的高产菌GS115/F3融合蛋白的表达量将近提高了一半，和出发菌株GS115/F2相比表达的蛋白质结构一致。影响外源蛋白在毕赤酵母中的表达因素还很多，它不仅受外源基因特性的影响，也受到宿主菌、Mut表型、酶切和糖基化及培养条件的影响，所以应从影响毕赤酵母蛋白表达的多种因素着手提高融合蛋白GGH的表达量，实现规模化制备。TheEndThankYou