毕赤酵母常用培养基与载体

毕赤酵母常用培养基与载体一、毕赤酵母表达常用载体：典型的巴斯德毕赤酵母表达载体载体包含醇氧化酶－1（AOX1）基因的启动子和转录终止子（5'AOX1和3'AOX1），它们被多克隆位点（MCS）分开，外源基因可以在此插入。此载体还包含组氨醇脱氢酶基因（HIS4）选择标记及3'AOX1区。当整合型载体转化受体时，它的5'AOX1和3'AOX1能与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同外源基因插入到受体染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。毕赤酵母本身不分泌内源蛋白，而外源蛋白的分泌需要具有引导分泌的信号序列。而由89个氨基酸组成的酿酒酵母的分泌信号—α交配因子(α-factor)引导序列已经成功地引导了几种外源蛋白的分泌。分泌表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL-S1，pPICZαA，pYAM75P等。胞内表达载体主要有：pHIL-D2，pA0815，pPIC3K，pPICZ，pHWO10，pGAPZ，pGAPZa(Invitrogen)，pPIC3.5K等。工程菌株Y11430，MG1003，GS115（AOX1），KM71，SMD1168。毕赤酵母宿主菌常用的有GS115和KM71两种，都具有HIS4营养缺陷标记。其中，GS115茵株具有AOX1基因，是Mut＋，即甲醇利用正常型；而KM71菌株的AOX1位点彼ARG4基因插入，表型为Muts，即甲醇利用缓慢型，两种菌株都适用于一般的酵母转化方法。多拷贝表达菌株的获得方式：与自主复制的质粒型表达载体不同，整合型表达载体的拷贝数可以有很大的变化。含多拷贝外源基因的表达菌株合成蛋白的量也较多。体内整合可通过高遗传霉素抗性，筛选可能的多拷贝插入；而体外整合可通过连接产生外源基因的串联插入。多拷贝表达菌株的获得方式有两种：一种是利用SDS-PAGE电泳、免疫杂交或菌落点杂交方法在大量的转化子中进行自然筛选。得到产量高的表达菌株。另一种在转化前将多个表达盒拷贝插入到单个载体中，而后再通过交换整合到受体染色体上。表达蛋白纯化方法：酵母系统表达的蛋白一般都具有活性，所以都采用较温和的纯化方式来纯化目的蛋白，分泌型表达的蛋白有利于纯化，可用硫酸铵沉淀，然后用离子交换，凝胶过滤层析，疏水层析等方法进一步纯化。具体的方法和操作应按所处理的目的蛋白的性质选择。二．毕赤酵母表达的培养基配制和用途2.1LB（Luria－Bertani）培养基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCll％PH7.0制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin25ug/ml。2.2LLB（LowSaltLB）培养基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCl0.5％PH7.0制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZαA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin25ug/ml，可以4℃条件下保存1～2周.2.3YPD（又称YEPD）YeastExtractPeptoneDextroseMedium，（YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基）Trypton2%dextrose(glucose)2%+agar2%+Zeocin100µg/ml液体YPD培养基可常温保存,是毕赤酵母的最基本培养基，琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin100ug/ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。2.4BMGY培养基Yeastextract1%Peptone2%磷酸钾缓冲液（pH6.0）100mmol/LYNB1.34%Biotin（4×10-5）%Glycerol1%毕赤酵母诱导表达前培养基，YNB和Biotin过滤除菌。培养24小时后，一般静置过夜，待酵母沉淀后倒掉BMGY培养基，改换BMMY培养基，进入诱导表达阶段。2.5BMMY培养基Yeastextract1%Peptone2%磷酸钾缓冲液（pH6.0）100mmol/LYNB1.34%Biotin（4×10-5）%methanol3%毕赤酵母诱导表达培养基，YNB和Biotion过滤除菌。摇瓶培养时每24小时之后加入3%的甲醇诱导，一般诱导72小时。2.6YPDS+Zeocin培养基（YeastExtractPeptoneDextroseMedium）：yeastextract1%peptone2%dextrose(glucose)2%sorbitol1M+agar2%+Zeocin100µg/ml不管是液体YPDS培养基，还是YPDS+Zeocin培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。2.7MGYMinimalGlycerolMedium（最小甘油培养基）（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。2.8MGYHMinimalGlycerolMedium+Histidine（最小甘油培养基+0.004%组氨酸）在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。2.9RDRegenerationDextroseMedium（葡萄糖再生培养基）（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）1.将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；2.冷却后于45℃水浴；3.将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤2的山梨醇溶液混合。4℃保存。2.10RDHRegenerationDextroseMedium+Histidine（葡萄糖再生培养基+0.004%组氨酸）在RD培养基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同时无菌水的体积减少至78ml即可，其余配制方法与RD相同。4℃保存。2.11RD及RDH平板的制备1.将186g的山梨醇和15~20g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3.迅速制备平板。4℃可保存数月。2.12RD及RDH的TOP琼脂的制备（常用于酵母菌的包被）1.将186g的山梨醇和7.5~10g琼脂粉定容至700ml，高压灭菌；冷却后于60℃水浴；2.参照RD/RDH液体培养基配制的步骤4，将100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml无菌水混匀，预热至45℃后，与步骤1的山梨醇/琼脂液混匀；3.将该TOP琼脂置于45℃水浴冷却、保温，备用。2.13MD与MDHMinimalDextroseMedium+（Histidine）最小葡萄糖培养基+（0.004%组氨酸）（含有：1.34%YNB；；4*10-5%生物素；2%葡萄糖）1.100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的无菌水定容至1000ml即可；2.如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；3.如配制平板，可无菌水的灭菌前，加入15~20g的琼脂。4℃可保存数月。2.14SOC培养基：Tryptonl％YeastExtract0.5％NaCl0.05％Glucose(1mol/L)2%121℃高压灭菌20min，冷却后，4℃保存。母液的配置注：10*YNB（含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基）4℃保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。500*B（0.02%生物素Biotin）4℃保存保存期为1年。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。100*H（0.4%Histidine组氨酸）4℃保存保存期为1年。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。10*D（20%Dextrose葡萄糖）保存期为1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。10*M（5%Methanol甲醇）保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。10*GY（10%Glycerol甘油）保存期为1年以上。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。100*AA（0.5%ofeachAminoAcid，各种氨基酸）4℃保存保存期为1年。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。1M磷酸钾溶液（potassiumphosphatebuffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。