毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选

毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选菌体的准备：1.挑取酵母单菌落，接种至含有5mlYPD培养基的50ml三角瓶中，30℃、250-300r/min培养过夜；2.取100-500µl（≤1:100）的培养物接种至含有50ml新鲜培养基的200mL三角摇瓶中，28~30℃、250-300r/min培养过夜(约20h)，至OD600达到1.3~1.5；3.将细胞培养物于4℃，1500g离心5min，用50ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬；4.按步骤3离心，用25ml的冰预冷的无菌水将菌体沉淀重悬5.按步骤3离心，用2-5ml，1M的冰预冷山梨醇溶液将菌体沉淀重悬；6.按步骤3离心，用160µl的冰预冷的1mol的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，其终体积约为240ul；备注：可将其分装为80µl一份的包装-70冷冻起来，2周之内使用，但会影响其转化效率。比如常见的pPIC9K的载体转GS115一般先用MD平板初筛，然后长出的克隆子可以挑到不同浓度的含G418抗性的YPD平板上筛选高拷贝。对正确筛选出的单菌落接YPD小瓶摇活后，转大瓶BMGY摇瓶发酵。一般对于甲醇诱导菌株，摇瓶一天左右后开始补加甲醇，就类似BMMY的功能了。KM71比GS115生长的要慢。毕赤酵母都应该是白色菌落的对于LOX家族蛋白的表达，可尝试在酵母培养基中加入Cu2+离子，提高表达量和蛋白活性?菌种保存：挑单克隆到YPD中培养18-24h,然后取菌液以1:1加入30%灭菌甘油，-80oCul/管冻存（一般用10ug以上质粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，约20ulddH2O重溶。转化效率一般大于100个克隆每ugDNA。建议你不要用胶回收kit，回收的DNA可能还有盐，导致电击时放电时间很短。乙醇沉淀主要步骤如下：1）酶切体系（80ul）中2倍体积的无水乙醇加1/10体积的PH5.2NaAC，混匀2)-20℃20分钟沉淀3)13200rpm，20min，离心后弃上清4)75%乙醇300ul轻轻洗，同上离心5min，弃上清5)37度烘箱至无乙醇气味（或是用摇床的出风口吹出的暖风吹）。6)20ulddH2O重溶）电击转化：8.将5~20µg的线性化DNA溶解在5~10µlTE溶液中，与80µl的上述步骤6所得的菌体混匀，转至0.2cm冰预冷的电转化杯中；9.将电转化杯冰浴5min；10.根据电转化仪提供的资料，参考其他文献及多次摸索，确定合适的电压、电流、电容等参数，按优化的参数，进行电击；11.电击完毕后，马上加入1ml1M的冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5ml的EP管中；（置于30度摇床低速培养1h，再涂板）12.将菌体悬液涂布于MD平板上，每200~600µl涂布一块平板；13.将平板置于30℃倒置培养，直至单个菌落出现（3-4天）。推荐：电压1.5kV；电容25µF；电阻200Ω。电击时间为4～10msec。Pichia酵母表达直接PCR鉴定重组子的方法1.平板上的菌落长到肉眼可见时（约12小时）；2.取1ml酵母悬液4000rmp离心，pbs重悬，煮沸5mins，放到冰上5mins，直接就可以用做pcr的模板了3.将除了模板之外的其它PCR反应液的组分准备好，并分装。3.用灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮一下，PCR扩增，利用5’AOX1和3’AOX1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入(如果重组质粒以单交换的方式整合到Pichiapastoris基因组，则会扩增到两条带，一条为2.2kb（KM71为3.6kb）宿主茵AOXI基因，另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor信号肽序列的片段。)Each50µlaliquotofcompetentPichiacellswith3µglinearizedplasmidDNAwillyield50coloniesonselectivemedium.Muts表型重组酵母的诱导表达实验Asageneralrulewheninducingexpression,neverallowculturestobemorethan10-30%ofyourtotalflaskvolume.1.挑选一单菌落，置于装有50mlMGY、BMG或BMGY培养基的500ml摇瓶中，于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6(~16-18h)；2.室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM,BMM或BMMY重悬菌体（约2.5~5ml）；3.将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长；4.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；5.按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、24、48、72、96和120h；6.对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。Mut+表型重组酵母的诱导表达实验1.挑选一单菌落，置于装有25mlMGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6(~16-18h)；2.室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用MM、BMM或BMMY重悬菌体，使OD600=1.0左右（约100~200ml）；3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长；4.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；5.按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。时间点一般取：0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；6.对分泌表达，分离样品的上清液；对胞内表达，分离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。BMGY和BMMY的换液方式有2种：1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。2）另一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶在无菌室静止4小时后，直接在酒精灯旁倾倒培养液，再加入诱导培养基，此种方法的缺点有少量生长培养基残留。是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。用新开启的分析纯甲醇，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取加入摇瓶就可以了。也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。麦芽浸提液培养酵母（不换液，补料），生长阶段结束后，密度可达到10-12，诱导培养结束后，密度可达到18左右。如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，加入1/10-1/2体积的BMMY进行诱导培养（即浓缩培养），细胞密度也可达到20以上。通常，真正的高密度发酵只有在发酵罐里才能实现，OD600可达到40-60及以上。摇瓶很难达到那样的密度，不过可以采取浓缩培养的方式实现高密度。摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。Mut+/Muts的筛选用SacI，SalIorStuI线性化插入HIS4位点的载体转化GS155后，多数转化子应为Mut+，但也有His+Muts的转化子存在（见Invitrogenprotocolp36），NotIorBglII线性化插入AOXI位点的载体转化GS155后，用MD/MM平板可区分Mut+/Muts。UsetheplatescontainingtheHis+transformantsandscreenfortheMut+andMutSphenotypeasdescribedbelow.1.Usingasteriletoothpick,pickonecolonyandstreakorpatchoneHis+transformantinaregularpatternonbothanMMplateandanMDplate,makingsuretopatchtheMMplatefirst.2.Useanewtoothpickforeachtransformantandcontinueuntil100transformantshavebeenpatched(2-3plates).3.TodifferentiateMut+fromMutS,makeonepatchforeachofthecontrols(GS115/His+MutSAlbuminandGS115/His+Mut+β-gal)ontotheMDandMMplates.4.Incubatetheplatesat30°Cfor2days.5.After2daysorlongerat30°C,scoretheplates.Mut+transformantswillgrowwellonbothMDandMMplates.MutStransformantswillgrowwellonMDplates,butshowlittleornogrowthontheMMplates.WerecommendpurifyingyourHis+transformantstoensureisolationofapureclonalisolates.YoumaydothisbeforeoraftertestingfortheMutphenotype.Replica-PlatingProcedureThisproceduregivesalowerrateofmisclassifications,butitincreasestheoverallMut+/MutSscreeningprocedureby2days.Youwillneedequipmenttoreplica-plate.1.Usingsteriletoothpicks,patch100His+transformantonMDplates(2-3plates).Forcontrols,makeonepatchfromeachofthestrainsGS115/His+MutSAlbuminandGS115/His+Mut+β-galontotheMDplates.2.Incubatetheplatesat28-30°Cfor2days.3.After2days,replica-platethepatchesfromtheMDplatesontofreshMMandMDplatestoscreenforMutStransformants.4.Incubatethereplicaplatesat28-30°Cfor2days.5.After2daysat28-30°C,scorethereplicaplates.LookforpatchesthatgrownormallyontheMDreplicaplatesbutshowlittleornogrowthontheMMreplicaplates.IncludingHis+Mut+andHis+MutScontrolpatchesoneachplatewillprovideexamplesofMut+andMutSphenotypes.Screeningby