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单细胞琼脂糖凝胶电泳（cometassay）SingleCellAgaroseGelElectrophoresis(SCGE)分析DNA损伤DNA损伤增加----comettail增大步骤：一、胞悬液的制备：1.吸弃旧培养基，PBS冲洗2遍。2.0.25%胰酶消化，待细胞变圆，间隙增大，立即终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞，使成细胞悬液，加入离心管，1000rpm，25℃离心10min，弃上清，以1mlPBS悬浮细胞，（以上应在暗室及较低温度下进行）。各组收集细胞2~3×106个（细胞悬液终浓度106个/ml），必须分散成单个。悬浮于1mlPH7.4PBS中，此步在暗室及较低温度下进行。浓度要求：100μL上胶中混30μL细胞悬液，在100x镜下视野有10-15个细胞，细胞呈圆形，不皱缩。二、玻片制备：1.玻片磨砂。2.制备0.7%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.7%低熔点琼脂糖(LMPA)各20ml。用pH7.4PBS配制。称0.14g溶于20mlPBS。（NMA与玻片附着不紧，可升高其浓度至0.7%，低浓度的下胶有显像清晰，高浓度附着玻片牢固不易洗脱，可以调节浓度在0.6%-0.7%）。铺第一层胶：0.5%NMPA100μl于磨砂玻片面，迅速盖上盖玻片，室温5min使其固化，即为第一层胶；第二层胶：37℃0.5%LMPA100μl+30μl（1-2x106）细胞悬液混匀，迅速铺于第一层胶上，盖新盖玻片，移入冰箱5min，使其固化。*余下的细胞1000g×10min离心，于0.1-0.2ml悬浮缓冲液中混匀，做Western-blot。余下细胞4℃锡纸避光，可以保存一周（用于重复试验）。三、细胞溶解：1.玻片缓缓浸入新鲜配制的冰凉（应用前冷藏30~60分钟）细胞溶解液中，4℃1小时（2-3h浸泡）或过夜。玻片在细胞消化液中可至少存放4周。细胞溶解液1L的配制500mlNaCl146.1g73.05gNa2EDTA37.2g18.6gTrisbase1.2g0.6g用约12克NaOH调节pH至10。6g定容至445mltriton5mlDMSO50ml配500ml用去离子水定容至890ml。过滤除菌，为贮备液。室温保存。应用液（现配现用）（粉剂定容至890ml水98%＋10mltritonx-1001%+100mlDMSO10%按比例配制即可）加入TritonX-100至1%DMSO至10%（消除血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的自由基）4、碱化处理及电泳：取出玻片，放入水平电泳槽中(正极端)，并列放置，不留空隙。倒入新鲜配制的冰冷电泳缓冲应用液，高于胶2mm，无气泡。放置40分钟解旋，本室一般采用20min，使DNA解链。20V,300mA电泳20分钟。通过调节液面来调电压。(电压先调到最大，电流300mA然后通过液面来调节电压)电泳缓冲应用液：10NNaOH30.0ml（12克）200mMEDTA5.0ml（二钠为0.372g）(附言：电泳缓冲液储备液：10NNaOH200g/500ml水，两周内用。200mMEDTA14.89g/200ml水，pH=10,室温保存。）定容至1000ml，混匀，电泳前新鲜配制。可通过改变液面高度来调节电压。U=IR，高度下降，横截面积下降则电阻上升。电压下降，减液。5、中和：切断电源，取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5min。中和缓冲液：Trisbase48.5g去离子水定容至1000ml用10mol/LHCL调节pH至7.5。室温保存。玻片过夜可以使用甲醇进行脱水固定。6、染色呈中性后，凉干玻片，用5μg/mlEB应用液染色5-10min，漂洗20-30min。EB染色液(10×贮备液)EB1mg去离子水20ml室温避光保存。临用时将贮备液稀释10倍。使终浓度为5μg/ml以上除中和及染色外，各步均应在暗处进行，以避免额外的DNA损伤。四、镜检及结果评价EB染色后的DNA样品应尽快在荧光显微镜下观察。未受损细胞表现为以圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。受损细胞则有彗尾伸向阳极，形成一个亮的头部和尾部。用目镜测微尺或拍摄×400倍照片再作判断。每个样品中至少随机挑选25个细胞测定。彗星尾长度35μm为未损伤35-70μm为中度损伤70μm为重度损伤