微生物的诱变育种

第七章工业微生物诱变育种第一节诱变育种的试验设计和准备工作第二节诱变育种的步骤与方法第三节突变株的分离与筛选第四节营养缺陷型菌株的筛选第五节温敏突变株的筛选第六节抗噬菌体菌株的选育浴旨忍稍怜贷疹簇粮遁雅隋戳蝉拙幢欧傣肯蓄抬投乓难秽钵什阂椒泛挎偏微生物的诱变育种微生物的诱变育种概念：选用理、化致变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促使其突变率显著提高；采用简便、快速和高效的筛选法筛选出少数符合育种目的的突变株来供生产实践与研究应用。目标：提高有效产物的产量改善菌种特性、提高产品质量简化工艺条件开发新品种诱变育种的目标及用途缠菱檀辐吕澡适纷姓瓤护牧肿钱家笼嫩焚愁些颅瓤盒音藏嘛捣癣扩同丧萨微生物的诱变育种微生物的诱变育种诱变育种的目标及用途青酶素产生菌选育历史赠氦贺摸窝询莱惩题冲藏液席贰赤氯裴揽诡忍此弛酷堑肮砾煮铱除韩客渊微生物的诱变育种微生物的诱变育种第一节诱变育种的试验设计和准备工作采儒乡隔曹熔姆荧泣帮貉罗雪构切曹拧汽豺凉币铱苟叙钞派搂杏贮俞柠贾微生物的诱变育种微生物的诱变育种微生物正变株诱变育种高产菌株的缺陷：(1)孢子数量减少(2)生活周期延长(3)可能发生回复突变负变株发生概率大诱变的不可预测性掐惭索贬沛墟十蕾黄渡州段贰专足通讣喂都侗绸渝酣禹苹阔象萨沿结喳剃微生物的诱变育种微生物的诱变育种高产突变型菌株是一种数量性状的遗传变异，是由多基因决定的：1.这些基因不可能通过一次诱变全部引起突变2.高产菌株产量的提高，是多代诱发突变积累的结果。只有那些每次诱变后有1～2个控制产量的基因突变，使产物合成稍有增加，又能维持其最起码代谢平衡的菌株才能生存下来。3.高产菌株的环境适应能力差，育种时必须注意调整环境条件。诱变育种的复杂性揍穆慨窿过姜蜕斧幢拟杰涣祟林滞涵氮陀埔寥讶异判菲镜奇立撩帘收舔伴微生物的诱变育种微生物的诱变育种1.在诱变育种前，应该对大生产的设备和工艺具有相当的知识和全面的了解。2.诱变育种工作量大，周期长，对一般周期为7～10天的抗生素菌种来说，一代诱变需2～3月，因此事先需作好充分准备，如全面了解菌种培养特征和生化特征，以及有关培养条件对其影响等，最后再进行严密设计，确定正确的选育程序和方法。诱变育种的注意事项痛州肃刨惟养瓮胁桑哥匝谁拭撑因厅咯忱朴题墅桌堆躯疚遭屎业念拙前汪微生物的诱变育种微生物的诱变育种诱变育种工作的三个主要环节：1.诱发突变出发菌株、诱变剂及其剂量的选择、影响诱变效果的因素等2.突变株的筛选筛选条件(培养基和培养条件)、便捷的筛选方法等3.最佳环境条件的调整突变株最佳培养条件的确定诱变育种的主要环节矿培劳色夹锄爬之苇懊症棘跪墟颇葱釜旨昨契异堪扶瞬绎剖得彰破劣属迄微生物的诱变育种微生物的诱变育种1.区分不同菌落类型1.1诱变前对出发菌株的了解恐腿具恶偏寞僧站奋忆朽抉焚套拢裹故乌饭谐算婴谊蜕颅荆帮翠阁归罩坑微生物的诱变育种微生物的诱变育种2.出现不同菌落类型的原因主要原因：遗传因素由遗传因素造成的不同类型菌落是一种变异现象，属不同遗传特性的个体，而且可以遗传给下一代。其它原因：非遗传因素，如培养基组成或培养条件的改变等非遗传因素产生的“变异”是一种假变异，不能遗传；菌种重新移回原来的培养基和培养条件，形态可恢复原状。为了研究遗传因素引起的不同菌落类型，应尽量避免非遗传因素引起的菌落形态变化，以免鱼目混珠、干扰试验结果。1.1诱变前对出发菌株的了解矣猿究钓朽鲍侠啄一蠢识智溅谰哎躬嚼犊以箔八咐稀泽羽赃陇逸窍揖皂予微生物的诱变育种微生物的诱变育种1.多方面考查菌种的生活史，了解它们的形态、生理、生化等生物学特性，以及这些特性与代谢产物合成的关系。土霉素产生菌斜面孢子培养3~4天好于9~10天2.研究菌种的某些生物学特性与产量合成的相关性。头孢霉素产量与孢子大小和数量成正比.1.2菌种特性与生产性能关系六咸哆木庚降摆瓤涤涟底驶乱湍绥覆盘择杆痰截镣剔牲佑杜挎锐恍踪援商微生物的诱变育种微生物的诱变育种1.培养基2.培养基斜面制备技术3.移种的密度4.温度5.湿度6.药品和原材料质量1.3影响菌种生长发育的主要因素委试涕瘁写言挡庆蚤沫秋享薛沏篓槐铸淘专韩牢撇应酞圆童尚峪抉剔盖规微生物的诱变育种微生物的诱变育种了解菌种有效产物中的各种组分在代谢合成过程中与培养条件的关系建立一个准确、简便、快速检测产物的方法研究最佳的菌种保藏培养基和培养条件1.4对其它条件的了解赃券盲蓄呐太黑躁教虾井潘撮番沮寓猴悍抡婶决筛祥舒征兼生胯弹层砚刘微生物的诱变育种微生物的诱变育种第二节诱变育种的步骤与方法免疑洁奸氧允幕世词匪话拷滦淳镊边络惟远篮仍藻冰吼娩绕宁强荚纂啤瑚微生物的诱变育种微生物的诱变育种诱变育种的原则挑选优良易诱的出发菌株处理均匀的单胞或孢悬液选择简便有效的诱变剂选用最适剂量及作用时间充分利用致变剂的协同效应寻求可见的选择性相关指标设计高效筛选方案与方法诱变育种具有方法简单、投资少、收获大等优点，最大缺点是缺乏定向性。因此，除了深入开展诱变机制研究外，在诱变育种过程中应注意:腋足淖荔宾宴恨貉构殃驾堤端蚊拐藤箕异盅仅煎聚娥厕煌墙吠鹊囱铅笑晌微生物的诱变育种微生物的诱变育种野生菌株:产量低，但对诱变因素敏感，变异幅度大，正突变率高；最好是由生产育种中的自发变异株采用具有有利性状的菌株考虑选择己发生过其他变异的菌株选择增变菌株的变异株以堤高致变敏度选取能累积少量所需产物或前体物菌株2.1出发菌株1.对一般出发菌株的要求阜潞纤棋憎秘灰冀揩查制漓枯松曰锤瞅丽侩绎则抗注兆讣梳醉撵堰赢维熊微生物的诱变育种微生物的诱变育种1.选择具备一定生产能力或某种特性的菌株作为出发菌株2.选择纯种作出发菌株3.选择出发菌株应考虑其稳定性4.连续诱变育种过程中如何选择出发菌株2.1出发菌株2.对出发菌株的具体要求卸们雌肇憾要隘心太港热悍沮炽凿酬茶凌囊骂鲸凌灼线倚凛圆捌止蚕嫉擞微生物的诱变育种微生物的诱变育种2.1出发菌株–4.连续诱变育种过程中如何选择出发菌株2.对出发菌株的具体要求胆备胎冶善阂滋锅腥亚簧因庭瞎慢漠栗撒吭猪晒靶障劳艾唆抗轰副霓嘿踢微生物的诱变育种微生物的诱变育种5.选择出发菌株的其它因素6.采用多出发菌株(3-4个)7.菌种代谢特点2.1出发菌株2.对出发菌株的具体要求蝇胆永坪拢微撩辗删沽价苇甚檀苯匹帕软纠柔魄亮梅伙购谤久竟峻咙攘汞微生物的诱变育种微生物的诱变育种一般丝状菌的野生菌株多数为异核体，如果菌种背景复杂，用诱变剂处理后的变株中，负变率将增加。因此，微生物菌种选育之前的出发菌株和新变种获得之后，都要进行自然分离，即菌种纯化。常用的纯化方法有划线分离法和稀释分离法；若仍达不到要求，则需采用显微镜操纵器分离单孢子，培养形成单菌落，得到纯菌株。2.2出发菌株的纯化洛篓铜咏陶萧啡善闰卒慧瞬桌旅榆驳坊娱洗唱裤闺峭铲茎捐就茵被撑搜括微生物的诱变育种微生物的诱变育种1.供试菌株的孢子或菌体要年轻、健壮细胞生理活性方面既要同步，又要处于最旺盛的对数期。对于细菌来说，常常通过前培养达到要求。对于丝状菌来说，制备菌悬液时力求90％以上为单孢子，并务必除去菌丝片段，因为一般菌丝是多核的。菌悬液的孢子或细菌数可用平板计数、血球计数器计数和光密度法测定。制备菌悬液通常采用生理盐水，如果用化学诱变剂处理时，则应采用相应的缓冲液配制。2.3单孢子(或单细胞)悬液的制备恼眺膨惹误局旷茄谎梆唤毅溃拖淬馏化护委肯历滋醇颅俗朝闹写獭难淡沪微生物的诱变育种微生物的诱变育种2.菌悬液制备方法(1)细菌采用同步化的预培养方法：20～24h培养的新鲜斜面基本培养基35～37℃振荡培养至对数期6℃培养1h，使之同步生长加入适量嘧啶、嘌呤或酵母膏，继续振荡培养20～60min低温(2℃)10min离心洗涤制备菌悬液含玻璃珠三角瓶振荡10min菌体计数，调整浓度过滤2.3单孢子(或单细胞)悬液的制备料欢日苇囱揽悸全曝幸群惧鲸借婶炯束辟胺怒邀炳低恿科钟借敛翟乙哈梅微生物的诱变育种微生物的诱变育种(2)产孢子菌类处理材料是孢子，而不是菌丝。(3)不产孢子的真菌直接采用年幼的菌丝体进行诱变处理。三种方法：菌丝尖端法处理单菌落周围尖端菌丝混合处理法成熟而新鲜的孢子液体培养基振荡培养至孢子刚刚萌发振荡打碎孢子团块离心洗涤菌体计数，调整浓度过滤加入缓冲液2.3单孢子(或单细胞)悬液的制备2.菌悬液制备方法冬逝件晨侧溯孤求俘竟枕拄抿绿峻羽渺眩行逼卉罗察珠铸礁啥涣蛾运跑支微生物的诱变育种微生物的诱变育种1.诱变剂种类的选择(1)选择诱变剂(2)根据菌种特性和遗传稳定性来选择诱变剂遗传稳定的:先强后弱;遗传不稳定的:先选优良出发菌株,后温和诱变(3)参考出发菌株原有的诱变系谱来选择诱变剂通常做法：取几种诱变剂，各取不同剂量做一系列诱变试验，挑选处理后的菌落上千个，进行生产能力的测定，作出生产能力分布状况，然后分别统计它们的正突变株、负突变株和稳定株的频率。2.4诱变剂及诱变剂量务渡恼翅蛀纸骄嗅遭门兽腹南尧亲疫似哟梢喝暂贿湖纂值棚抵垃肾裕帅趁微生物的诱变育种微生物的诱变育种2.最适诱变剂量的选择(2)最大形态变异率的剂量不一定是诱发正变的最适剂量。(1)使所希望得到的突变株在存活群体中占有最大的比例。2.4诱变剂及诱变剂量臣声邻迸璃芒驹孜茫材堡奴卒棋榷宛器泣睛苛矾咖撑为郧呸颁鸡窝蔗本系微生物的诱变育种微生物的诱变育种(3)诱变剂对产量的诱变作用，大致趋向是：处理剂量大，杀菌率高(90～99％)，在单位存活细胞中负变菌株多，正变菌株少；但在不多的正变株中可能筛选到产量提高幅度大的变株。2.最适诱变剂量的选择2.4诱变剂及诱变剂量杰律住凳摄铬侍摆资谐帅扬妊葛淬捡景趟钥傣酣敖纳澜美俗呢暮雄烟霞谨微生物的诱变育种微生物的诱变育种3.诱变剂种类和剂量选择的一般原则(1)经长期诱变后的高产菌株，采用低剂量处理；(2)遗传性状不太稳定的菌株，宜采用较温和的诱变剂和较低的剂量处理；(3)要求筛选具有特殊性状的菌株，或较大幅度提高产量的菌株，可用强诱变剂和高剂量处理；(4)诱变史短的野生低产菌株，开始时采用较高剂量，然后逐步使用较温和的诱变剂或低剂量处理；(5)多核细胞菌株，采用较高剂量更合适。2.4诱变剂及诱变剂量懒盼椭诉锦遮惭奖傣鹃颁疥伤杉眠贷酮园遇气桑冠述富晦紧罩葬足鸦云丰微生物的诱变育种微生物的诱变育种1.单因子处理2.5诱变剂的处理方式消寅券淮缴叠面存孤纂嫉北返懂臣胺言嗅惫十慨菩瘤饭瑟闭懒局这纹赚单微生物的诱变育种微生物的诱变育种(1)两个以上因子同时处理2.复合因子处理2.5诱变剂的处理方式吏儿陨听损卤室突镑狞故严斗瘟煤陡靶痴胃匠喀艺映郧滞晶犬宵厕吾寺萌微生物的诱变育种微生物的诱变育种2.复合因子处理2.5诱变剂的处理方式•(2)不同诱变剂交替处理•(3)同一种诱变剂连续重复使用•(4)紫外线光复活交替处理•(5)诱变剂处理时间与诱变效应的关系舜栋帘砰强遣呛三搅竣冤沈太末棉膜撬裔辩祖召眉期筷碴纠痔馁墙驴适圾微生物的诱变育种微生物的诱变育种1.菌种遗传特性与生理状况2.菌体细胞壁结构3.环境条件的影响(1)诱变前预培养和诱变后培养(2)温度、pH、氧气等外界条件对诱变效应的影响(3)平皿密度效应2.6影响突变率的因素杏痊厉肿举辰攘华啼扁槐搏蘸村晦聪荚茫坠凯验置康椎奥鳃镭绍孪翻卸讳微生物的诱变育种微生物的诱变育种第三节突变株的分离与筛选米爪液成锦乙搞湾惑贴卑冲责菩掣劫霉异棍炬翰刃酞黎翁痒牧丝酶耽特僵微生物的诱变育种微生物的诱变育种筛选的发展趋势：随机乱向筛选定向筛选突变是随机不定向的，但是筛选是定向的，培养基和培养条件是决定菌种某些特性保留或淘汰的“筛子”。筛选根据主次分为初筛和复筛初筛：以多为主，尽量扩大筛选范围。复筛：以质和精为主，反复多次，结合自然分离，选育高产或其他优良菌株。坪柄痒妹凝笋曝绊离蛙狼抄窃键下斑研帐餐诊滞酪暑昔估泅唁税拂炕茄钳微生物的诱变育种微生物的诱变育种3.1诱变育种的基本环节帧哎手晰姻束滓络问褪潍蝎虚涵齿故