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生物学大实验（二）实验名称：质粒扩增、提取和鉴定实验实验目的通过对智力扩增、提取和鉴定试验的实验原理介绍和实际操作，加深对分子生物学基本技术的理解和掌握。实验仪器设备：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、摇床、离心机、不同型号移液枪若干支、磁力搅拌器、恒温水浴锅、电炉、制冰机、琼脂糖凝胶电泳仪、超净工作台等。实验原理：质粒主要存在于细菌、放线菌和真菌细胞中，通过对细菌、放线菌和真菌的培养来实现对质粒的扩增。经过处理的线状DNA在外界环境恢复正常的时候不能够复性而质粒DNA可以复性，从而可以实现质粒DNA和染色体DNA的分离。限制性内切酶能特意地结合于一端被称为限制性酶识别系列的DNA系列之内或其附近的特异位点上，并切割DNA。当对提取的质粒DNA进行电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。实验步骤：一质粒扩增（1）普通LB固体培养基制备：制备LB培养基，倒入灭菌瓶中高压灭菌，待完全冷却后，保存备用。（2）将大肠杆菌接种于LB培养基中，37℃振荡培养过夜(200转/分)二质粒DNA的提取(碱法)1将菌液倒入1.5ml的微量离心管中，12000rpm离心一分30秒，弃去上清液，以得到较多的细菌沉淀；2、将微量离心管开口倒置在卫生纸上，使离心管底部的液体流尽。3、加入100μl用冰预冷的溶液I，剧烈振荡，将沉淀彻底悬浮，然后室温放置5分钟。4、加入200μl现配的溶液II，盖紧管口，轻轻快速颠倒离心管（不要振荡，以避免DNA断裂），使混合物混匀，冰浴5～10分钟。5、加入150μl预冷的溶液III，盖紧管口，温和颠倒混匀，使粘稠地细菌裂解物均匀地分布于溶液III中，冰浴5分钟。6、取上部水相，移入新的离心管，加入2倍体积预冷的无水乙醇（也可同时加入1/10倍体积的醋酸钠），震荡混匀，室温放置10分钟沉淀双链DNA，然后4℃，12000rpm离心10min。7、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使离心管底部的液体流尽后，加入预冷的1ml70％乙醇。8、弃去上清液，将离心管倒置于卫生纸上，使液体流尽，置DNA干燥5～10分钟。9、吸除上清液，将管口倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于34υlTE缓冲液或灭菌水（pH8.0）中，储于-20℃冰箱中三DNA酶切反应1、将洁净干燥并经灭菌的eppendorf管（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入DNA（υl）和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2υl，将管内溶液混匀后加入0.5υl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可以用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。此步操作是整个实验成败的关键，要防止错加，漏加。使用限制性内切酶时应尽量减少其离开冰箱的时间，以免活性降低。2、混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），37℃水浴锅保温2-3小时，使酶切反应完全。3、每管加入2υl0.1mol/LEDTA（pH8.0），混匀，以停止反应，置于冰箱之保存备用。四DNA的琼脂糖凝胶电泳1、取5×TBE缓冲液100ml加蒸馏水至1000ml，配成0.5×TBE稀释缓冲液，待用。2、胶液的制备：称取3g琼脂糖置于1000ml锥形瓶中，加入300ml0.5×TBE稀释缓冲液，加入微波炉里加热至琼脂糖全部融化，取出摇匀，此为1%琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使其附于瓶盖上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜，以减少水分蒸发。3、胶版的制备：想冷却至50-60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭（EB）溶液使其终浓度为0.5υlg/ml。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀，速度也不可太快，否则溶液出现气泡，待胶完全凝固后，拔出梳子注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0.5υ×TBE稀释缓冲液至页面恰好没过胶板上表面4、加样：取20υl的酶解液与2υl10×载样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中，每加完一个样品要更换tip头以防止互相污染，注意上样时要小心操做，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿5、电泳：加完样后合上电泳槽盖，立即接通电源，控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上，当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿2cm时停止电泳6、观察和拍照五实验结果六实验结论通过本次试验加深了对分子生物学以及基因工程的深入了解，右上第三第四根亮柱是我的结果。结果显示，第三条中酶切效果良好，RNA被降解的很完全，第四根没有被酶切，质粒DNA跟RNA同时存在，出现了两条亮带，质粒DNA跟RNA分离效果较好。本实验需要细致认真的完成，所以特别在凝胶电泳中要十分注意以下事项：（1）取出梳子之前，一定要耐心等待琼脂糖凝胶的凝固，拔梳子是一定要手稳，而且要垂直拔出；（2）点样要细心，枪头不要碰到凝胶，以免点样枪刺破凝胶；（3）电泳时，电极一定要连接正确（4）染色剂溴化乙锭是强诱变剂，有致癌性和强毒性，使用时一定要带一次性手套，使用后废液不可不可随意丢弃。生物科学071班姓名：刘欢学号：20073305