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五日生化需氧量（稀释培养法）一、方法概述1.原理生化需氧量（BOD5）是指在规定条件下，微生物分解存在于水中某些可氧化物质，特别是有机物所进行的生物化学过程中消耗溶解氧的量。此生物氧化过程进行的时间很长,如在20℃暗养时,完成此过程需100多天。目前国内外普遍采用20±1℃培养5d，分别测定样品培养前后的溶解氧。二者之差即为生化需氧量（BOD5），以氧的毫克/升表示。2.干扰及其消除对某些地表水及大多数工业废水，因含较多的有机物，需要稀释后再培养测定，以降低其浓度，并保证有充足的溶解氧。稀释程度以培养后消耗溶解氧大于2mg/L或剩余溶解氧大于1mg/L为宜。为了保证水样稀释后有足够的溶解氧，稀释水通常通入空气进行曝气（或通入氧气），使稀释水中的溶解氧接近饱和。稀释水中还应有一定量的无机营养盐和缓冲物质（磷酸盐、钙、镁、铁盐等），以保证微生物生长的需要。对于不含或少含微生物的工业废水，其中包括酸性废水、碱性废水、高温废水或经过氯化处理的废水，在测定BOD时应进行接种，以引入能分解废水中有机物的微生物。当废水中存在着难于被一般生活污水中的微生物以正常速度降解的有机物或含有剧毒物质时,应将驯化后的微生物引入水样中进行接种.3.适用范围本方法适用于测定BOD5大于或等于2mg/L,最大不超过6000mg/L的水样。当水样BOD5大于6000mg/L，会因稀释带来一定的误差。二、仪器和设备1.恒温培养箱（20±1℃）2.20升细口玻璃瓶3.稀释容器：1000-2000ml量筒或容量瓶4溶解氧瓶（培养瓶）：250-300ml，带磨口玻璃塞，瓶口上部周围可以水封。5虹吸管（供分取水样和添加稀释水用）6曝气装置:多通道空气泵或其他曝气装置;空气可能带来有机物、氧化剂和金属，导致空气污染，如有污染，空气应过滤清洗。7溶解氧测定仪三、试剂除测定溶解氧所需的试剂外，还需要下列试剂：1.氯化钙溶液：称取27.6g无水氯化钙溶于水中，稀释至1000ml。2．氯化铁溶液：称取0.25g六水合氯化铁（FeCl3·6H2O）溶于水中，稀释至1000ml。3.硫酸镁溶液：称取22.5g七水合硫酸镁(Mg2SO4·7H2O)溶于水中，稀释至1000ml。4磷酸盐缓冲溶液：称取8.5g磷酸二氢钾（KH2PO4）、21.75g磷酸氢二钾(K2HPO4)、33.4g七水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·7H20)和1.7g氯化铵(NH4Cl)溶于水中，稀释至1000ml。此溶液的PH为7.2。*以上四种溶液中若有微生物生长，则应弃去，重新配制。5.稀释水：在20升玻璃瓶内装入一定量的水（含铜量小于0.01mg/L，瓶子上方适当留有空隙），用脱脂棉封口，放置在（20±1℃）恒温箱内一周，溶解氧可达到8mg/L左右，临用前于每升水中加入上述四种试剂各1ml，混匀。*稀释水的PH应为7.2，否则可用磷酸或磷酸三钠溶液调整，稀释水的五日生化需氧量应小于0.2mg/L方可使用。6.盐酸溶液（0.5mol/L）：将40ml（p=1.18g/ml）盐酸溶于水，稀释至1000ml。7.氢氧化钠溶液（0.5mol/L）：将20g氢氧化钠溶于水，稀释至1000ml。8.葡萄糖-谷氨酸标准溶液：将葡萄糖（C6H12O6）和谷氨酸（HOOC-CH2-CH2-CHNH2-COOH）在103℃干燥后1h后，各称取150mg溶于水中，移入1000ml容量瓶内并稀释至标线，混合均匀。此标准溶液临用前配制。该溶液也可少量冷冻保存,融化后立刻使用.9.稀释水：在5-20L玻璃瓶内装入一定量的水，控制水温在20℃左右。然后用无油空气压缩机或薄膜泵，将吸入的空气先后经活性吸附管及水洗涤管后，导入稀释水内曝气2-8h，使稀释水中的溶解氧接近于饱和（曝气亦可导入适量纯氧）。瓶口盖以两层经洗涤晾干的纱布，置于20℃的培养箱中放置数小时，使水中溶解氧含量达8mg/L左右。临用前每升水中加入氯化钙溶液、氯化铁溶液、硫酸镁溶液、磷酸盐缓冲溶液各1ml，并混合均匀。稀释水的PH应为7.2，其BOD5应小于0.2mg/L。10.接种液：可选择一下任一方法，以获得适用的接种液。（1）城市污水，一般采用生活污水，在室温下放置一昼夜，取上清夜供用。（2）表层土壤浸出液，取100g花园或植物生长土壤，加入1L水，混合并静置10min。取上清夜供用。（3）用含城市污水的河水或湖水。（4）污水处理厂的出水。（5）当分析含有难于降解物质的废水时，在其排污口下游适当距离处取水样作为废水的驯化接种液。如无此种水源，可取中和或经适当稀释后的废水进行连续曝气，每天加入少量该种废水，同时加入适量表层土壤或生活污水，使能适应该种废水的微生物大量繁殖。当水中出现大量絮状物，或检查其化学需氧量的降低值出现突变时，表明适用的微生物已进行繁殖，可用作接种液。一般驯化过程需要3-8d。11.接种稀释水分取适量接种液，加于稀释水中，混匀。升稀释水中接种液加入量为：生活污水1-10ml；或表层土壤20-30ml；河水或湖水加10-100ml。接种稀释水的PH值应为7.2，BOD5值以在0.3-1.0mg/l之间为宜。接种稀释水配制后应立即使用。四、操作步骤1.水样的预处理（1）水样的PH值超过6.5-7.5范围时，可用盐酸或氢氧化钠溶液调节使PH接近7左右。但用量不要超过水样体积的0.5%，若水样的酸碱度过高，可改用高浓度的碱或酸进行中和。（2）水样中若含有铜、铅、镉、铬、砷及有机毒物时，将妨碍微生物的生长，可使用经过驯化的微生物接种液的稀释水进行稀释，或者提高稀释倍数以减少毒物浓度。或采用其它适当方法去除，而不改变水样的性质。（3）含有少量游离氯的水样，放置1-2h后，游离氯即可消失。对于游离氯在短时间不能消散的水样，可加入亚硫酸钠溶液除去。其加入量由下述方法决定。取已中和好的水样100ml于碘量瓶中，加入（1+1）乙酸10ml，10%（m/v）碘化钾1ml，摇匀。以淀粉溶液为指示剂，用亚硫酸钠标准溶液滴定游离碘。由亚硫酸钠溶液消耗的体积，计算出水样中应用亚硫酸钠溶液的量。（4）水样温度应调节到20℃左右，再稀释培养，含有过饱和溶解氧的废水样应把溶解氧降到20℃的饱和程度。可把水样温度提高到20℃左右，瓶内水样不要盛满，充分振荡，以赶出过饱和的溶解氧。2.不经稀释水样的测定（1）溶解氧含量较高、有机物含量较少的水，可不经稀释而直接以虹吸法将约20℃的混匀水样转移两个溶解氧瓶内，转移过程中应注意不使产生气泡。以同样的操作使两个溶解氧瓶充满水样后溢出少许，加塞。瓶内不应留有气泡。（2）其中一瓶随即测定溶解氧，另一瓶的瓶口进行水封后，放入培养箱中，在20±1℃培养5d。在培养过程中注意添加封口水。（3）从开始放入培养箱算起，经过五昼夜后，弃去封口水，测定剩余的溶解氧。3.废水样的稀释：废水样稀释采用一般稀释法或直接稀释法。（1）稀释倍数的确定：工业废水，由重铬酸钾法测得的COD值来确定。通常需作三个稀释比。使用稀释水时，由COD值分别乘以系数0.075、0.15和0.25三个系数。（2）稀释操作：①一般稀释法：a，按照选定的稀释比例，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀释水（或接种稀释水）于1000ml量筒中，用移夜管加入需要量的均匀废水样，再引入稀释水（或接种稀释水）至800ml。用玻璃搅棒小心上下搅匀，搅拌时勿使搅拌橡皮板露出水面，防止产生气泡。b.用少量稀释水样冲洗培养瓶，将稀释好的废水样分别装于两个有编号的培养瓶内，直到充满后溢出少许。如果瓶壁内有气泡，要轻击瓶口使之溢出。小心地盖紧瓶塞，勿使瓶内存有气泡，瓶口用水封闭。同法配制另外两个稀释比的废水样。c.另取两个有编号的培养瓶，用虹吸法装满稀释水作为空白，若用接种稀释水稀释样品，则取两瓶接种稀释水为空白。d.将各稀释好的废水样、稀释水及接种稀释水各取一瓶放入20±1℃培养箱内匹配样五日，剩余的各一瓶放置15分钟后测定培养前溶解氧（D0、B0）。e.每天检查瓶口是否保持水封，经常添加封口水。同时检查培养箱温度是否为20±1℃，必要时作为适当调整。f.培养五天后取出培养瓶，倒尽封口水，立即测定培养后的溶解氧（D5、B5）。②直接稀释法是在培养瓶内直接稀释。在已知准确容积的培养瓶内用虹吸法加入部分稀释水（或接种稀释水），再加入根据培养瓶的容积和稀释比计算出的废水水样量，然后用稀释水（或接种稀释水）充满，盖上瓶，勿留气泡于瓶内。其它操作与上述一般稀释法相同。4.BOD5测定中，一般采用叠氮化钠改良法测定溶解氧。如遇干扰物质，应根据具体情况采用其它改良法（参《水和废水监测分析方法》第六章-四、“溶解氧”）。5.结果计算：选取培养后消耗溶解氧大于2mg/L或剩余溶解氧大于1mg/L范围的稀释培养液，并按下式计算：BOD5=〔（D0-D5）-（B0-B5）×Vb/800〕×800/Vs式中：B0——稀释水（或接种稀释水）在培养前的溶解氧（mg/L）；B5——稀释水（或接种稀释水）在培养后的溶解氧（mg/L）；D0——水样（或接种稀释水）在培养前的溶解氧（mg/L）；D5——水样（或接种稀释水）在培养后的溶解氧（mg/L）；Vb——稀释水（或接种稀释水）在培养液中所占比例；Vs——水样在培养液中所占比例。注:本方法与GB7488-87等效。