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热原检查法程春雷山东省药品检验所主要内容热原检查法的简介具体的修订内容修订的背景热原检查的适用性研究体外热原检查法热原检查法的简介-1热原（Pyrogen）的含义指临床上能使哺乳类动物产生热原反应的物质的总称。其本质系指某些药品中含有的能引起体温升高的杂质。Thetermderivesfromthegreekword“pyros”(fire)andwasapparentlyusedfirstbyBillbroth热原的种类热原检查法简介-2热原反应因输注药液引起病人发热、寒战、头痛、昏迷、休克甚至死亡等反应。热原经静脉注入人体后15分钟即能产生强烈的发热反应，重者昏迷甚至危及生命热原检查法简介-3热原反应机理热原进入人体循环系统后，刺激人外周血单核细胞和巨噬细胞释放细胞因子(即内致热原)如白介素－1(IL-1)、白介素－6(IL-6)、白介素－8(IL-8)、肿瘤坏死因子－α(TNF－α)等。内热原性细胞因子作为信号分子通过PG－E2（神经中枢内引起发热的重要“终介质”）传导信号，提高视丘下部的温度调定点，激发体温调节机制使体温升高，体温过高可使人休克，甚至死亡热原物质及发热机理热原检查法简介-420世纪20年代Seibert采用家兔动物模型，通过系列实验证明了引起注射发热的物质来源于细菌，其对热稳定，并可通过滤器。之后，Seibert和其同事共同建立了用于检测药品终产品质量的热原试验热原检查法简介-51941年《美国药典》修订委员会首次组织了对热原的协作研究，有FDA、NIH和14个药厂参加，使用253只家兔进行了3300次实验，研究结果于1943年发表，并促使1942年USP第12版首次正式收载家兔热原实验方法，为注射用药提供了一个有效和可靠的热原检测手段我国1953年第一版药典收载了家兔热原检测方法热原检查法定义：本法系将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含热原的限度是否符合规定。2010版与2005版区别2010版2005版1、体重1.7kg以上（三部未改变）体重1.7~3.0kg2、其中升温达0.6℃的家兔应休息2周以上——3、____*每一家兔的使用次数，用于一般药品的检查，不应超过10次。*三部仍规定，对血液制品、抗毒素和其他同一过敏原的供试品在5天内可重复使用1次。2010版2005版4、在做热原检查前1-2日在作热原检查前1-2日5、温度相差不得大于3℃，且应控制在17～25℃（指实验室和饲养室）实验室和饲养室的温度相差不得大于5℃，实验室的温度应在17～25℃6、实验室温度变化不得大于3℃应注意实验室温度变化不得大于3℃2010版与2005版区别2010版与2005版区别2010版2005版7、应防止动物骚动防止动物骚动8、置于宽松适宜的装置中置于适宜的装置中9，深度一般约6cm，时间不得少于1.5分钟时间不得少于1分半钟10、且同组各兔间正常体温之差不得超过1℃且各兔间正常体温之差不得超过1℃2010版2005版11、与供试品接触的试验用器皿应无菌、无热原。去除热原通常采用干热灭菌法（250℃、加热30分钟），也可采用其他适宜的方法试验用器的注射器、针头及一切与供试品溶液接触的器皿，应置烘箱中用250℃加热30分钟，也可采用其他适宜的方法除去热原2010版与2005版区别2010版2005版12、3只家兔体温升高总和低于1.3℃（三部未变，仍为1.4℃）13、高于0.6℃，低于3.5℃3只家兔体温升高总和低于1.4℃0.6℃以上，3.5℃以下2010版与2005版区别修订背景１、热原实验是一个整体的动物实验，易受许多因素的影响。动物自身的行为、生理、外部环境以及一些实验过程等都可影响结果的准确性。２、对家兔体重取消了上限3.0kg，同时取消家兔使用次数不超过１０次的规定。（与国外药典一致、提高家兔利用率、灵敏度不受影响）修订背景３、增加了升温达0.6℃的家兔应休息2周以上新要求。（防止假阳性）4、实验环境要求更加严格：实验室与饲养室温度相差由不大于5℃改为3℃5、强调同组各家兔间温差不大于1℃，对家兔固定方式：宽松。6、判定标准更加严格：初试的3只家兔体温升高总和低于1.4℃改为低于1.3℃。3只1.3℃计合格限值平均0.4333），纠正了初试时合格要求值（3只1.4℃计平均0.4633℃）大于复试后合格要求值（8只3.5℃计平均0.4375℃）的不合理性。本修改相应提高了复试率，判断标准基本一致，提高了结果的可靠性。标准要求稍低于美国药典，但高于英国、日本、欧洲药典。修订背景实验用兔灵敏度测试每年不定期随机抽取体重和使用次数不同的实验用兔，按热原检查法要求注射５EU/kg或10EU/kg内毒素标准品，应得到不符合规定的结果。热原检查适用性研究新品种建立热原检查标准时，建议进行适用性研究，在不影响家兔正常生理的前提下，按人用每公斤体重每小时最大供试品剂量的２－５倍设定限值。（化学药品一般为２－３倍，中药为３－５倍）。热原检查适用性研究适用性试验时设三组：⑴限值剂量的供试品组⑵10EU/kg内毒素组⑶含10EU/kg内毒素的供试品组。适用性试验判定：⑴组符合规定，⑵、⑶组不符合规定表明该品种可建立热原检查项。体外热原检查法建立一种更合理、更适宜的热原检测模型，为药典提供一个完善可行的热原检测替代及补充方法。该研究对于提升我国药品质量控制的总体能力，避免今后国际贸易中的相关技术壁垒具有重大现实意义和社会价值。家兔法：费用高结果重复性差使用活体动物实验传统热原检测方法的不足内毒素法：只能检测细菌内毒素鲎资源日益匮乏随着各种新技术产品的出现及现有方法存在的问题，传统热原检测方法日趋落后，不适应于产品的热原检测。外热原人体（分泌内热原）体温调节中枢发热新方法主要以应用动物来源或人源细胞模拟人体，通过检测内源性热原（主要为细胞因子，如IL-6、IL-1、TNF-α）在体外进行热原检测。新方法原理细胞（分泌内热原）新方法国外研究现状国外对新方法的研究始于20世纪80年代，国际发达国家实验室，包括英国国家生物制品检定所NIBSC、德国国家疫苗及血清研究所PEI等，均对新的体外热原检测替代方法开展了研究。2010版欧洲药典已收录了5种新体外热原检测方法：①人新鲜全血—IL-1β法②人新鲜全血—IL-6法③人冻存全血—IL-1β法④MM6细胞—IL-6法⑤PBMC细胞—IL-6法新方法优点①不使用动物进行体内实验②能真实地模拟人体对热原的反应③能检测非内毒素热原④能定量或半定量⑤能被广泛地应用⑥操作简单可行新方法国内研究现状国内对新方法的研究与国际相比有一定差距，2010版中国药典未收录新热原检测方法。国家药典委员会已经启动了体外热原检查法的课题，山东所是课题组成员之一。已开展的研究方法兔新鲜全血法鼠新鲜全血法人新鲜全血法人冻存全血法PBMC细胞法