AKTA层析系统

AKTA层析系统标准操作规程在使用AKTA前，请先阅读本规程，并了解所需层析方法的原理。初次使用请在有经验的人指导下进行。1.缓冲液和层析的样品的准备：1.溶液需用去离子水、超纯水或注射用水配制，除NaOH和乙醇外，所有用于层析的缓冲液需经0.45μm孔径的滤膜过滤，并盛装于用0.45μm孔径滤膜过滤的水至少荡洗4次的容器中。2.实验过程中用到的20%乙醇应用新的无水乙醇和0.45μm孔径滤膜过滤的水配制；0.1MNaOH用0.45μm孔径滤膜过滤的水和固体NaOH配制。3.盛装缓冲液的应使用小口有盖圆底容器，最好可灭菌，如蓝口瓶，无水乙醇瓶。烧杯（敞口，易污染长菌）、血清瓶（多死角，易长菌）不适合用于盛装缓冲液。4.配制的缓冲液成分不宜浓度过高，如硫铵不得超过2M（约50%饱和硫铵）；NaCl不得超过4M；PB不得超过500mM；以免析出固体损坏层析介质与仪器。5.缓冲液要多次使用，需在120℃灭菌20min，此后置于4℃保存，下回层析时平衡至室温使用，使用前应摇晃无可见异物方可使用，否则，应重新过滤。6.用于层析的样品通常要用12000rpm离心10min，上清用0.22μm过滤后才可以用于层析。经过层析后收集的样品如无沉淀可免去离心和过滤的步骤。7.用于离子，疏水层析的样品应经预实验不会在该层析条件下样品在低盐和高盐条件下稳定不析出沉淀。2.AKTA仪器的使用：1.开关机⑴开启电脑，检查电脑运行状态是否正常。⑵开启AKTA总电源按钮(AKTA仪器一般分为2-3个模块，每个模块有单独的电源开关，通常为开启状态，总电源开关一般用于开关仪器)，稍后开启AKTA控制软件UNICORN，并等待仪器自检和联机，每个模块自检成功后会发出“嘀---嘀嘀”的声音，相应在仪器上显示自检通过的字样。软件开启后会同时打开4个界面，从左到右依次是：文件管理界面、程序编辑界面，仪器控制界面，图线分析界面。与仪器连接成功后，仪器控制界面下方仪器简图线路变成绿色，仪器会从泵内走一段液体至废液。如未连接成功，操作界面会弹出提示窗口，此时请检查仪器与电脑数据线插头是否松动，而后关闭仪器和程序，重新开启，必要时可重新启动电脑。如经过以上步骤还无法连接，请联系管理员。⑶使用完仪器应在文件管理界面关闭UNICORN程序，系统将提示是否锁定界面，选否，待UNICORN完全退出后方可关闭仪器电源。使用完毕后需清理台面，并登记使用事项。2．AKTA仪器的运行⑴在打开流速之前，将AB管道插入缓冲液中，遵循A低盐，B高盐或者A高pH,B低pH的原则，若只用一种缓冲液，请将AB管道都插入缓冲液中，然后AB泵各走50%。在装上柱子之前应先用高流速将管道中替换成自己相应缓冲液。⑵若样品量低于10mL，用上样环进样比较简便和准确。选用合适上样环，在装柱前连接上仪器，在清洗管道时调至inject一并清洗，并且装上层析柱后随柱子一起平衡。上样时，先在inject下插入注射器，调至load，打入缓冲液，改为inject，上样。⑶在仪器控制界面可通过电脑控制流速，A/B泵流速比例，上样环状态切换，UV归零，压力上限，以及标注和定时暂停等。流速和压力控制要按照不同的介质、柱型号的使用方法严格严格执行（参数见附表）。特别需要注意的是，在使用时要设定最高压力警报，以避免操作不当造成柱子爆裂，甚至仪器损坏。AKTA使用过程中请检查各部分的运行情况，如有问题及时联系管理员。⑷同时，在使用时，请确保位于仪器一侧的，50mL管装的20%乙醇正在循环流动（用于清洗压力泵），并且20%乙醇无浑浊或干涸现象。若发生断流或液体浑浊，请及时更换并用注射器抽取，让液体充满管道，避免对压力泵造成损害。⑸使用NaOH以及盐浓度较高的缓冲液清洗管道或柱子时尽量减少漏液，如漏到仪器上时请及时擦拭干净，避免腐蚀AKTA。柱子使用完后要及时拆卸，以便他人使用。注意柱子拆卸后要在相应接口连接一条管道，避免污染杂质，染菌或检测探头由于缓冲液干涸盐析造成损坏。⑹当发现压力检测器或pH计不准时，及时通知管理员进行校正。⑺运行结束后请及时保存实验结果，并归于各人自己目录下，便于整理和存档。三、层析柱和介质的使用：1.装柱⑴原先在溶液中的介质通常可以用水或乙醇（20%）装柱，干粉介质（如G25）需在水中溶胀1h以上，方可装柱。CHTII需在200mMPB溶液中溶胀1h后，用200mMPB装柱。⑵拆下柱子，清洗柱腔和管道，将位于下方的一端（较短的）接上AKTA仪器，揭下防水膜，以5~10mL/min流速排出防水膜下的气泡，盖上防水膜，装上柱腔，继续在柱腔底部注满2cm左右的溶液，将计算好体积的介质贴壁缓慢倒入柱腔内，要防止气泡的产生。将管道从仪器上卸下，让溶液流出，介质随着沉降。当介质沉降完全后，堵上下端出口。⑶将位于上方的一端接上仪器如⑵排去气泡后，向柱腔内缓慢注水至上柱面，将上端插入柱腔，锁在介质面上方约1cm处。⑷按附表中相应柱子介质的流速压介质5min，当介质面稳定后用笔在柱外相应位置做记号。稍微松开上方，将上端压至标记处，（CHTII介质压至标记上方1mm处）旋紧。层析柱就可以使用了。⑸分子筛类介质应倒装层析柱。2．层析柱和介质使用注意事项⑴TSK的高压预装柱也可以在AKTA上使用，但要注意流速和压力（详见附表）⑵在装柱和卸柱时要将柱头上的液体充满，再连上连接头或堵头。装柱时要先用1/2流速倒冲柱子，赶出气泡，再连上接头，以免气泡进入介质内。⑶实验过程中应保持柱子竖直，特别是分子筛。整个实验操作过程中都要防止气泡进入介质内。常压层析柱使用较久后，柱压可能会上升，应适当降低流速。若层析柱在实验过程中出现泵压急剧升高，超过限度的情况，请联系管理员。⑷在实验结束后，非高压柱应用0.1MNaOH清洗，最后保存于NaOH或20%乙醇中；CHTII介质用0.1MNaOH清洗不宜超过2倍柱体积，最后应保存于水或20%乙醇中；高压预装柱除G3000SW外用0.1MNaOH清洗，保存于超纯水中；G3000SW用超纯水清洗，保存于超纯水中。柱子卸下时，2端柱头都应先充满液体，再接上堵头，放4℃保存，经常使用的可放室温保存。四.使用后登记及台面清洁1.将使用的各部件放置原有位置，在登记表上如实填写仪器使用状态，登记使用日期和使用人。2.带走自己的物品，保持桌面清洁。再次注意，仪器上如有缓冲液外漏，请擦拭干净以免腐蚀仪器。撰写人：魏旻希13950005441柱子型号压力上限最大流速（装柱）最大流速（运行）其它要求XK16/200.5MPa25mL/min20mL/minXK16/1000.5MPa2.5mL/min2mL/min通常装分子筛介质XK26/200.3MPa12mL/min8mL/min附表：各层析柱与介质的参数1、常压柱：1.常压预装柱：包括HiTrapSepharoseFF系列，HiTrapSepharoseHP系列，HiTrapSepharoseXL系列，HitrapDesalting（G25）系列，Superdex系列：柱子类型压力上限最大流速（运行）其它要求HiTrapXXXSepharoseFF（1mL）0.3MPa1mL/minHiTrapXXXSepharoseHP（1mL）0.1MPa1mL/minHiTrapXXXSepharoseXL（1mL）0.3MPa1mL/minHitrapDesalting（5mL）0.3MPa3mL/minHitrapDesalting（10mL）0.3MPa10mL/minSuperdex75/2000.6MPa0.75mL/min　2.常压柱子（进口）：XK26/600.3MPa25mL/min20mL/minXK26/1000.3MPa12mL/min8mL/min通常装分子筛介质有夹套的进口柱子，XKA/B表示内径为A（mm），高为B（cm）3.常压柱子（国产）：柱子型号压力上限最大流速（装柱）最大流速（运行）其它要求15*200.5MPa25mL/min20mL/min15*1000.5MPa2.5mL/min2mL/min通常装分子筛介质25*200.5MPa25mL/min20mL/min25*400.5MPa25mL/min20mL/min35*400.5MPa25mL/min20mL/min35*600.5MPa25mL/min20mL/min　国产柱子，A*B表示内径为A（mm），高为B（cm）4.4.常压介质：介质压力上限最大流速（装柱）最大流速（运行）其它要求XXXSepharoseFF0.5MPa25mL/min20mL/min快速介质，可高流速XXXSepharoseHP0.3MPa12mL/min10mL/min高效介质，不耐高压XXXSepharoseXL0.5MPa25mL/min20mL/min大载量介质，可高流速XXXCapto0.5MPa25mL/min20mL/min新介质，可高流速G250.5MPa25mL/min20mL/min干粉，需预溶胀Superdex2000.5MPa2.5mL/min2mL/min分子筛介质CHTII0.5MPa12mL/min10mL/min干粉，200mMPB预溶胀，装柱，不耐高压，不耐NaOHSPA(ProteinA)-Sepharose4B0.5MPa22mL/min20mL/min可用乙醇清洗，不能用NaOH清洗CHTII为BioRed产品，SPA(ProteinA)-Sepharose4B自产，其余为GE产品。2．高压预装柱：介质压力上限最大流速（运行）其它要求TSK-gelXX5pw7.5*750.5kPsi/0.6MPa1mL/minTSK-gelXX5pw21.5*1500.5kPsi/0.6MPa6mL/minTSK-gelG5000PWXL7.8*3000.1kPsi/0.3MPa0.5mL/minTSK-gelG3000SWXL7.8*3000.1kPsi/0.3MPa0.5mL/min不能用于pH7.5的缓冲液TSK-gelG3000SWXL21.5*6000.6kPsi/0.6MPa6mL/min不能用于pH7.5的缓冲液TOSOH产品：A*B表示内径为A（mm），高为B（mm）原本1kPsi=145MPa，但AKTA系统（泵和管道）不适合耐受太高压力。