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Westernblot实验技术易发平基础医学院生物化学与分子生物学教研室定义：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法WesternBlot基本原理在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。WesternBlot一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白1.水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。盐析沉淀出的蛋白质一般保持着天然构象。常用的中性盐是硫酸铵。细胞裂解液：50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNacl,5mmol/LEDTA,1%NP40，0.05%PMSF，2μg/mLAprotinin,0.5μg/mLLeupeptin，pH8.0蛋白样品的制备2.低温有机溶剂提取法蛋白质处在一定量的有机溶剂中，分子间极性基团的静电引力增强，水化作用降低，蛋白质聚集而沉淀。对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。该法沉淀蛋白质的选择性较高，不需脱盐。3.水溶性多聚物沉淀法聚乙二醇（PEG）、葡聚糖（DEX）等溶于水中，蛋白质的极性基团与多聚物分子中的氧或氢氧根结合，形成二者的复合体，从溶液中沉淀析出。改变多聚物的浓度可分段沉淀出不同的蛋白质。4.通过层析或电洗脱法、色谱等制备目的蛋白重组蛋白的特点：目的蛋白质的量较多，至少占总蛋白量的1%，常为5%-9%，使纯化易于进行。可利用融合蛋白质的特性进行纯化。利用标示物（tag）的特性，用亲合层析柱，可快速分离纯化融合蛋白质，最后切除tag即可。很多表达载体已带有tag的DNA序列。重组蛋白的特点：包含体的形成。主要出现在大肠杆菌等原核生物中，溶解度很小的蛋白都进入包含体中，包含体中的蛋白质主要是外来性的重组蛋白。离心的方法先收集包含体，再从中分离蛋白。分泌蛋白质的生成。目的蛋白前加入信号肽序列，可使真核细胞内表达的蛋白分泌到培养基中，因其中的蛋白质种类较少而使目的蛋白的分离纯化得以简化。大肠杆菌等有细胞壁的细胞可分泌至周质中，收集细胞后，改变渗透压，同时加入少量溶菌酶破坏细胞壁，提取周质后，纯化目的蛋白。蛋白样品的定量生物化学所学的方法都可以。凯氏定氮法、双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法。凯氏定氮法：蛋白质中氮在浓硫酸作用下生成铵盐，与浓NaOH作用，产生氨气，吸收于标准硼酸溶液中，用标准酸直接滴定，测出含氮量，按蛋白质恒定的含氮量（16%），换算出蛋白的含量。福林-酚法（Lowry法）：蛋白质中的酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸残基与Cu2+结合，生成复合物，进而还原酚试剂的磷钼酸，生成蓝色化合物，用比色法测定。蛋白样品的定量紫外吸收法：蛋白质在280nm左右有吸收高峰（因色氨酸和酪氨酸的吸收），不同的蛋白，其中色氨酸和酪氨酸的含量各异，因此A280值不同。Bradford法考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比。(上样量)其他商品化的试剂盒也可测蛋白含量。蛋白样品的定量试剂：考马斯亮蓝工作液，0.1N盐酸，双蒸水，蛋白标准液（将10mg/ml蛋白溶液稀释至4.0mg/ml,3.5mg/ml,3.0mg/ml,2.5mg/ml,2.0mg/ml,1.5mg/ml,1.0mg/ml,0.5mg/ml。）管号012345678ddH2O807070707070707070蛋白标准液01010101010101010样品101010101010101010HCl101010101010101010SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳原理：蛋白质进行PAGE时，其迁移率取决于所带的净电荷量以及分子的大小、形状等因素。如在胶中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇使蛋白分子中的二硫键还原。SDS使蛋白的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。大量的SDS结合后，各种蛋白都带上相同的负电荷，大大超过了蛋白原有的电荷量，因而原有的电荷差别可忽略。所以，蛋白质的迁移率主要取决于它的分子质量。丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis）聚合而成的分子筛，孔径大小由二者的总浓度及Bis的浓度决定。Bis一定的情况下，总浓度越高，孔径越小。TEMED过硫酸铵（APS）(时间)TEMED及APS激发网状结构的形成。分子氧阻止链的延长，防碍聚合作用。所以凝胶液需排气，在水或水饱合异丁醇隔绝空气的条件下反应。SDS配胶的Tris缓冲液Tris-甘氨酸电泳缓冲液凝胶成份凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212浓缩胶浓缩蛋白质的原理在不连续SDS-PAGE时,采用了两种缓冲液浓度、pH值和凝胶孔径，上层胶为浓缩胶（大孔径），下层胶为分离胶（分子筛）。浓缩胶中的缓冲对为Tris-HCl，电泳Buffer的缓冲对为Tris-甘氨酸。电泳时，胶中的Cl-移动最快，电泳缓冲液中的甘氨酸（pI为6.0）在浓缩胶pH6.8时解离度很小，故移动最慢。而SDS-Protein在无分子筛效应的大孔径浓缩胶中移动速度居第二。即泳动速度为Cl-蛋白甘氨酸离子。随着电泳的进行，Cl-与后面的蛋白带之间形成电势梯度，同样的蛋白与甘氨酸离子之间也会形成电势梯度。高电势使蛋白质和甘氨酸离子的移动速度加快，形成一个迅速移动界面。由于蛋白质的有效泳动度居第二，使蛋白质聚集在这个移动界面附近，被浓缩成一狭窄的中间层。所以，加样后，通过此浓缩过程，都能形成一狭窄的区带。电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。**预染蛋白质分子量标准包含了从19kD到117kD共6种纯化的预染蓝色蛋白质，可以直接使用，无需煮沸。每次上样5-10微升，就可以在电泳时、电泳后或转膜后观察到非常清楚的蛋白条带。1）电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥，电压越小，条带越漂亮。转膜膜的选择尼龙膜硝酸纤维素膜封闭非特异性抗体结合麻烦简单快速封闭非特异性抗体结合价格昂贵价格便宜特殊要求下的选择需要更高的蛋白结合率（尼龙膜：480µg/cm2；硝酸纤维素膜：80µg/cm2）目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱需要更大的机械强度PVDF膜蛋白结合量最高，机械强度也高，其上的蛋白可用染料染色也可免疫显色，但使用前需处理。特别适于氨基酸组成分析和序列分析。转膜半干法按：用缓冲液湿润滤纸3张、膜、凝胶、缓冲液湿润滤纸3张顺序放置，电转10－30min。但高分子量的蛋白转移效率较低。湿法将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。具体条件需考虑蛋白分子大小及样品中蛋白实际含量高低。转膜后检测丽春红S染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次，脱色。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。封闭脱脂奶粉（5％）BSAWesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）目的：防止抗体与膜的非特异性结合。封闭液选择在进行抗体杂交之前，需要采用异源性蛋白质先对转印膜进行封闭，防止免疫试剂的非特异性吸附，从而降低背景，增加灵敏度，提高信噪比。常用封闭物有脱脂奶粉和BSA（稀释于不同的缓冲液中），但不同的抗原-抗体反应，封闭条件均不相同。牛奶封闭液可能含有能与抗山羊类抗体交叉反应的IgG,由此产生非特异性背景。建议使用casein（年奶中的酪蛋白）或BSA做封闭。一抗、二抗孵育把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4℃过夜。洗去未结合的一抗：回收一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，37℃一小时，4℃过夜。洗去未结合的二抗：倒掉二抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。回收一抗溶液？在Western或免疫荧光染色等操作后，请注意回收稀释的抗体。回收的抗体在进行Western或免疫荧光染色时至少可以重复使用10次。稀释后的抗体，包括已经使用过的稀释抗体，4℃保存。回收后重复使用的抗体，使用方法同新鲜稀释的抗体。如果在重复使用过程中发现抗体出现轻微混浊现象，可以10000g离心1-3分钟，取上清用于后续检测。如果回收的抗体出现明显的絮状物或长霉长菌等情况，则可以考虑废弃该抗体。一抗选择免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。单抗：识别单个抗原表位，所以特异性高。但如果所识别的抗原表位被破坏，则会影响实验结果，这也是单抗的缺点之一；多抗：虽然存在交叉反应的问题，但由于识别多个抗原表位，所以即使有少数几个抗原表位被破坏，仍然不会影响实验结果，这是多抗的优点之一。二抗算不算多余？一抗不能显色吗？一抗是特异性的，常用单抗。二抗要求广谱抗体，最好能够一对多。一抗如果是鼠抗人的抗体，二抗应该是另一种动物抗鼠的抗体，而且一抗和二抗的动物种属原则上不应该相同。一般来说，一抗多用兔抗和鼠抗，而二抗多用羊抗。二抗与底物反应显色•辣根过氧化物酶法（HRP）•碱性磷酸酶法（AP）•化学发光显色法(HRP)在同一张膜上检测目的蛋白和内对照（β-actin，GAPDH），应先上目的蛋白的一抗、二抗，显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，显色、压片、洗片。DAB、ECL法都能达到纳克的要求。ECL是一种增强显色法，灵敏度要高，但显色麻烦，发表文章常用。DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。Ecl显色原理：氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。注意：荧光在一段时间后会越来越弱。常用显色法的原理成功的例子A.RT-PCR;B.WesternblotC.ColImRNA数据分析D.ColI蛋白数据分析杂交结果的分析Westernblot可以特异性检测某个蛋白质分子，进行定量和半定量分析，但是不能定位。定量WesternBlot技术需要具备两个必要条件。其一：信号必须稳定，保证不同时间点检测都可以得到相同的结果；其二：信号的强弱必须与目标蛋白深度成比例关系。利用红外激光器产生的激光激发红外荧光染料，产生的发射光由高灵敏度光电二极管检测荧光信号强