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发酵工艺学原理复习题参考答案（2011级）第二章1.比较固体培养与液体培养的优缺点。固体培养优点：（1）酶活力高。（因为菌丝体密度大）（2）生产过程中无菌程度要求不是很严格。（3）对于固体培养，通常用于固体发酵，由于产物浓度大，易于分离，可以有效的降低产品分离成本。缺点：（1）生产劳动强度较大，占地面积大，不宜自动化生产。（2）周期长。（3）培养过程中环境条件控制较难。（4）生产过程中，由于无菌程度较低，其菌种菌类不纯。液体培养优点：（1）生产效率高，便于自动化管理。（2）生产过程中温度、溶氧、pH值等参数可以实现全面控制。（3）通常生产液体种子，整个生产周期较短。缺点：（1）无菌程度要求高，相对生产设备投资较大。（2）对于某些种类的发酵，液体培养因投资大、生产密度大而难以实现。2.说明菌种扩大培养的条件。菌种扩大培养条件因不同的菌种差异是非常大的，通常是与菌种的性质有关的，也与后续的发酵工艺有关。但是，与发酵工艺却有着很大的差别。1.培养基：种子培养基因不同的微生物种类差别是很大的，同一种微生物因不同的扩大培养过程（一级、二级）其培养基往往也有较大差异。通常，对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基也不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。2.温度种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。需要指出的是：（1）许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：30℃，而产物合成温度为32-34℃（2）种子扩大培养的温度的选择，应该考虑的是菌体的快速增殖上，一方面可以缩短周期，另一方面有利于抑制其他杂菌的生长。3.氧的供给菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气，无论是厌氧发酵还是好氧发酵。足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、搅拌轴功率等4.pH值菌种扩大培养的pH值很重要，直接影响到菌体的正常生长，需要注意以下两点：（1）扩培选择的pH值是菌体的最适生长pH值，往往与发酵最适pH值不同。（2）培养基灭菌后，通常其pH值要下降0.5——1.0个单位3.菌种扩大培养的目的和意义是什么？（1）提供大量而新鲜的、具有较高活力的菌种。目的是：a、缩短发酵周期，降低能耗、减少染菌的机会（空气过滤设备有效时间是有限的）b、为了使培养菌在数量上取得绝对的优势，抑制杂菌的生长。（2）让菌种从固体试管、液体试管、三角瓶、种子罐、发酵罐逐级扩大，逐步适应大环境的生产。（3）菌种经过扩大培养，可以提高生产的成功率，减少“倒罐”现象。通过连续的扩大培养，每一级都要进行严格的检查，对于不合格的严禁使用，增加了生产的可靠性。4.工业生产用菌种的基本要求有什么？（1）具有稳定的遗传学特性（2）微生物生长和产物的合成对于基质没有严格的要求（3）生长条件易于满足（“临界溶氧浓度”pH值等）（4）对于细菌，希望具有抗噬菌体的能力。（5）具有较高的各种酶活力，可以在一定的范围内提高生长速率和反应速度，进而可以缩短发酵周期，降低生产成本。（6）对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎；对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内，对于包含体，要求在细胞破碎时不易破碎，而在目的产物的分离提出时，则易破碎。5.微生物发酵常用的菌种有哪些？1.细菌类：短杆菌：GA,Gln,lys……枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶)α-Amylase苏云金芽孢杆菌：BT生物农药……梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等的发酵2.酵母菌啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵酒精酵母：汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵假丝酵母：scp生产，石油发酵3.霉菌黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业（UV-11,UV-48）、酶制剂工业（糖化酶）黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱青霉菌：青霉素的生产红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒（女儿红）的生产；使用红色色素的生产；豆腐乳的生产等赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生长激素4.放线菌：各种抗生素，链、土、庆大等第三章1.微生物发酵培养基的碳源主要有哪几种？（1）淀粉及其水解糖液（2）含有淀粉及其水解产物的废弃物：味精废水、粉丝生产废水等（3）化工石油产品：醋酸、甲醇、乙醇、甲烷等（4）纤维素2.微生物发酵培养基的氮源主要有哪几种？①无机氮源:氨水、尿素（有脲酶微生物）、(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4CL等②有机氮源:豆粕、玉米浆、酵母粉、酵母浸出物、鱼粉、菌体蛋白、玉米蛋白粉等3.淀粉的水解方法主要有什么？试进行优缺点比较？酸法水解的主要副产物是什么？淀粉的水解方法主要有酸法、酶法以及介于这两者之间的酸酶法、酶酸法。酸法:（优）生产方法简单易行；对设备要求简单；水解时间短；生产能力大。（缺）反应条件比较强烈；产生的副产物较多。双酶法：（1）酶促反应条件温和，水解产生的副产物少，对微生物的生长有利。双酶法淀粉水解首先使用耐高温α-淀粉酶进行淀粉的液化，此时水解液中的葡萄糖很少，不具备生成副产物的物质条件。（2）淀粉水解产率较高，通常糖的转化率可以提高10%以上。（3）可以直接使用粮食进行双酶法水解，因为双酶法水解的条件温和，对于粮食中的蛋白质等其他物质的破坏较少。（4）双酶法水解使用的淀粉乳浓度较高，可以达到20Be以上，而采用酸法水解，淀粉乳的浓度通常只有12Be。酸法水解的主要副产物:（1）双分子葡萄糖脱水，形成复合二糖，分别是异麦芽糖、龙胆二糖。前者不利于产物的结晶提出；后者对于菌体的生长有抑制作用。（2）一分子葡萄糖脱水，形成5-羟甲基糠醛，对于菌体的生长有抑制作用。（3）一分子葡萄糖和-NH2反应，形成氨糖，是淀粉水解糖液有色物质的主要来源。4.双酶法淀粉的水解通常使用哪2种酶？其作用特点分别是什么？α-淀粉酶:又称为淀粉液化酶，只作用于淀粉α-1，4葡萄糖苷键，其作用特点是可以快速将长链的淀粉水解成短链糊精，其水解速度随着淀粉链长度的降低而变得越来越慢，换言之，该酶不可能将淀粉完全水解成葡萄糖，因此该酶的淀粉水解产物中以短链的糊精为主，含有少量的葡萄糖。淀粉α-1，4；1，6葡萄糖苷酶:又称糖化酶，可以水解淀粉分子的α-1，4或α-1，6葡萄糖苷键，其作用特点是，淀粉的分子链越短水解速度越快，水解产物为葡萄糖。5.培养基工业灭菌的方法主要是采用蒸汽灭菌，其灭菌的原理是什么？灭菌过程符合对数残留定律，写出理论灭菌时间的计算公式。灭菌就是杀死一切微生物，包括微生物的营养体和芽孢，在工业生产中，对于培养基、管道、设备的灭菌，通常采用蒸汽加热到一定的温度，并保温一段时间的灭菌方法，称之为湿热灭菌。借助蒸汽释放的热能使微生物细胞内蛋白质、酶、核酸分子内部的化学键特别是氢键受到破坏，引起不可逆的变性，致使微生物死亡。在有水分存在的情况下蛋白质更易受热而凝固变性。湿热灭菌的显著优点是：使用方便，无污染，而且其冷凝水可以直接冷凝在培养基中，也可以通过管道排出。理论灭菌时间:t=2.303/k*lnN0/NS实际生产中:间歇灭菌:121℃20-30min连续灭菌:137℃15-30s在维持罐中保温8-20min6.生物反应器灭菌的操作要点有什么？将配置好培养基打入生物反应器内进行实消，操作要点如下：（1）定期检查设备、管道有无渗漏，主要是：冷却管道，夹套。（2）培养基升温时，打开所有的排气阀门，排掉空气，当培养基的温度升到灭菌温度时，进入保温操作阶段，此时要求与反应器相连的所有管道处于两个状态：进汽或出汽，目的是对管道进行灭菌。（3）培养基升温时开动搅拌系统，以使培养基内部传热均匀，当温度升温到100℃时，停止搅拌，一方面是为了保护轴承，另一方面，当培养基的温度升温到100℃时，培养基的沸腾，可以起到搅拌作用。（4）注意辅助设备的灭菌：空气过滤器、计量罐、流加管道与流加液贮罐，空气流量计等。（5）保温期间，要求罐压：0.09—0.10MPa，温度：118—121℃，时间：30分钟。（6）灭菌结束后，需要立即引入无菌空气，保证罐内压力后方可冷却，目的是防止培养基的冷却使罐内形成负压，易染菌。（7）配制培养基时，应充分考虑培养基在灭菌时的稀释（体积的增加），通常体积可增加20%左右，灭菌时间越长，体积增加的越多。7．以化学反应动力学为基础，说明高温短时灭菌可以减少培养基营养成分损失的原因。培养基的灭菌过程实际上是营养成分破坏、菌体死亡的两个平行性反应，对于平行性反应，反应温度的提高，其两个平行性反应的速度常数都增加，但增加的幅度（大小）却不同，其比值可以表示为：lg(k2/k1)/lg(k,2/k,1)=E/E,……(5)实验证明：营养成分为破坏的反应的活化能E的值为E,=8.36—83.6*103J/mol而菌体死亡的活化能E芽孢：E=418*103J/molE=无芽孢：E=209—250*103J/mol显然，（5）式的比值〉1，说明提高温度对于第二个平行反应，即菌体死亡的反应是有利的。提高温度，虽然两个平行性反应的反应速度常数都提高了，但是，达到同样的灭菌效果，所需要的时间却缩短了，由于第一个反应也就是营养成分破坏的反应速度常数增加的少，因此，有利于减少培养基在灭菌过程中营养成分的破坏。换言之，高温短时灭菌对于培养基营养成分是有利的。8．掌握以下几个概念：理论灭菌时间：理论计算中培养基的灭菌过程所用的时间t=2.303/k*lnN0/NS式中——N0，NS：分别表示灭菌前、灭菌后培养基中菌体的浓度（个/ml）--k:表示灭菌过程中菌体死亡的速度常数对数残留定律：即微生物的热致死规律，在一定温度下，微生物热死遵循分子反应速度理论，在微生物受热失活的过程中，微生物不断被杀死，活菌数不断减少，其减少速度随活菌残量的减少而降低。—dN/dt=K*N实消：将配置好的培养基放在发酵罐或其他容器中，通入蒸汽将培养基和所用设备一起灭菌的操作过程。优点：不需要特定的设备，操作、管理比较灵活。空消：在生物反应器内没有物质时对其进行灭菌。意义：由于空消时反应器内的死角少，蒸汽的传热效率高，对于反应器灭菌效果好，通常在较长时间没有使用的反应器、染菌的反应器、更换菌种时都要进行空消。采用培养基连续灭菌的工艺，需要空消。连消:将配制好的培养基在向发酵罐等培养装置输送的同时进行加热、保温和冷却而进行灭菌。优点:营养成分破坏少，生产效率高；热综合利用率高；大型企业自动化程度高。第四章1.基本概念：能荷：生物体所具有的能量水平。能荷=（[ATP]+1/2[ADP]）/（[ATP]+[ADP]+[AMP]）显然，能荷在0—1之间。甘油发酵：在厌氧或好氧条件下培养酵母，利用糖分解生成甘油的过程。侧系呼吸链：NAD(P)H经过该呼吸链，可正常传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，不能够正常产生ATP的呼吸链称之为侧系呼吸链。标准呼吸链：NAD(P)H经过该呼吸链，可正常传递H+，将其氧化为H2O，并能正常氧化磷酸化生成ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。二氧化碳固定化反应：二氧化碳在酶的作用下转化为还原性有机化合物的过程初级代谢：是指微生物合成它们生长所必需的物质的诸如：糖、氨基酸等以及由这些化合物形成的高分子物质如：多糖、蛋白质、核酸等的代谢，称之为初级代谢。那么，这些化合物统称之为：初级代谢产物。次级代谢：是指微生物在生长后期进行的与他们的生长无明显关系的代谢，这一类的物质统称之为：次级代谢产物。例如：抗生素、激素、某些酶制剂等。分叉中间体：处于代谢的分叉点上，既可以合成初级代谢产物，又可用来合成次级代谢产物，把微生物的初级代谢和次级代谢紧密联系起来的物质。发酵逆转：