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研究用CodeNo.6013说明书pMD™19-TVectorCloningKitv201412Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存1●纯度1●用途1●pMD19-TVector的结构1●实验操作2■ControlDNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2■一种可供选择的快速克隆法3●相关说明4●使用注意4●Q&A5-1-●制品说明pMD19-TVector是一种高效克隆PCR产物（TACloning）的专用载体。本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。此外，本制品中的高效连接液SolutionI可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。本制品中的ControlInsert（500bp）还可以用于Control反应。本载体与pMD18-TVector相比，本制品的β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。●制品内容（20次量）pMD19-TVector（50ng/μl）20μl×1支ControlInsert（50ng/μl）10μl×1支SolutionI*75μl×2支*使用时请于冰中融解。●保存：-20℃●纯度■ControlInsert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有InsertDNA片段。●用途■进行TA克隆，克隆PCR产物。■对克隆后的PCR产物使用BcaBESTSequencingPrimers、M13Primers进行DNA测序。●pMD19-TVector的结构-2-【pMD19-TVector相关位点说明】Cloningsite431BcaBESTSequencingPrimerM13-47bindingsite352-375BcaBESTSequencingPrimerRV-Mbindingsite484-507LacZoperator146-475ColE1ori873-1461Ampr1632-2492●实验操作■ControlDNA片段的克隆实验A）操作方法1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。试剂使用量pMD19-TVector*11μlControlInsert*21μldH2O3μl2）加入5μl（等量）的SolutionI。3）16℃反应30分钟。注）①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。4）全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。5）42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。6）加入890μlSOC培养基，37℃振荡培养60分钟。7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。8）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。B）结果使用ControlInsert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×108cfu/μgpUC19DNA。ControlInsert连接/转化效率（cfu/μgVector）白色菌落比率（%）效率（%）*＋2.8×10696.390以上－2.2×10540.20*效率是指白色菌落中的目的DNAInsert片段的连入效率。■一般DNA片段的克隆实验1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。试剂使用量pMD19-TVector*11μlInsertDNA*30.1pmol～0.3pmoldH2Oupto5μl-3-2）加入5μl（等量）的SolutionI。3）16℃反应30分钟。注）①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。③长片段PCR产物（2kb以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时。4）全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。5）42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。6）加入890μlSOC培养基，37℃振荡培养60分钟。7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。8）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。■一种可供选择的快速克隆法*41）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。试剂使用量pMD19-TVector*11μlInsertDNA*30.1pmol～0.3pmoldH2Oupto5μl2）加入5μl（等量）的SolutionI。3）16℃反应30分钟。注）①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。③长片段PCR产物（2kb以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时。4）取2μl上述连接液（10ngVectorDNA）加入到microcentrifugetubes中，冰上冷却2min。5）取50μlE.coliJM109CompetentCell加入到上述microcentrifugetubes中，混匀并冰浴5min。6）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养（平板使用前需要在37℃预热30分钟），形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。*1pMD19-TVector的使用量取0.5μl实验也可得到满意的结果。实际操作时，可按实验需要确定T载体的使用量。pMD19-TVector1μl（50ng）的摩尔数约为0.03pmol。*2ControlInsertControlInsert为500bp的3′末端带有A碱基的PCR产物，ControlInsert1μl（50ng）的摩尔数约为0.15pmol。*3InsertDNA的使用量在进行克隆时，VectorDNA和InsertDNA的摩尔比一般为：1：2～10。*4快速克隆法该克隆方法的效率会有所下降，但此方法操作简单、迅速，是一快速克隆DNA片段的方法，可以满足一定客户的需求。-4-●相关说明1.感受态细胞的选择。转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率≥1×108cfu/μgpUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F’编码的［LacZ△M15］）产生ωFragment，才可能和载体DNA产生的LacZα多肽相结合，表现出β-半乳糖苷酶活性（α-互补性）。2.InsertDNA的要求。InsertDNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用Takara凝胶回收试剂盒（CodeNo.9762）。3.InsertDNA使用量的计算方法。进行克隆时，VectorDNA和InsertDNA的摩尔数比一般为1：2～10，我们可以根据自己的实验情况选择合适的VectorDNA和InsertDNA的摩尔数比。InsertDNA使用量的计算方法如下：InsertDNA的使用量（ng）=nmol数×660×InsertDNA的bp数本载体1μl（50ng）的摩尔数约为0.03pmol。4.阳性克隆的检测。DNA片段成功插入至pMD19-TVector中后，一般情况下β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与LacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称，2kb的DNA片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试着检测蓝色菌落。进行阳性克隆检测时，我们建议使用PCR的方法，扩增用引物可以使用BcaBESTSequencingPrimers，可以对菌体直接进行PCR扩增。5.阳性对照实验。为了确认实验操作的正确性以及实验试剂的有效性，我们建议进行阳性对照实验。按照实验操作方法，使用试剂盒中提供的ControlInsert，可以进行10次阳性对照实验。6.转化效率的计算。取0.1ng的pUC19PlasmidDNA加入至100μl的热转化感受态细胞中后，再加入900μl的SOC培养基（0.1ngDNA/ml），将上述培养液稀释10倍后（0.01ngDNA/ml）取100μl涂布平板（0.001ngDNA/100μl），记录菌落数。以得到200个克隆体为例计算转化效率，此时的转化效率=200cfu/0.001ng=2×105cfu/ng=2×108cfu/μgpUC19DNA。●使用注意1.SolutionI请于冰中融解。2.克隆时使用的InsertDNA片段（PCR产物）建议进行切胶回收纯化，否则PCR产物中的短片段DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响TA克隆效率。3.按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20μl。当要转化的DNA量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用Dr.GenTLEPrecipitationCarrier（CodeNo.9094）可以提高DNA的回收率。4.连接反应请在25℃以下进行，温度升高（26℃）较难形成环状DNA。连接效率偏低时，可适当延长连接反应时间至数小时。5.本制品来源于pUC19载体，因此，适合pUC19载体的感受态细胞都可以使用，如：JM109等。-5-●Q&AQ-1怎样提高连接转化效率？A-11.确认InsertDNA片段的3’末端是否带有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶（如:TakaraPyrobest、KOD、Pfx、Pfu等）扩增的PCR产物是平滑末端，不能直接进行TA克隆。2.纯化PCR产物。最好使用切胶回收的PCR片段，以除去PCR产物中的非特异性片段和引物等杂质。进行切胶回收时可以使用Takara凝胶回收试剂盒（CodeNo.9762）。3.请使用转化效率大于108cfu/μgpUC19DNA的感受态细胞。4.DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。5.进行切胶回收纯化DNA片段时，不要使DNA片段在紫外线下暴露时间过长。6.SolutionI应尽量避免反复冻融。7.建议使用新配制的平板培养基。Q-2转化后的菌落全为蓝色，但有目的DNA片段的插入，为什么？A-2插入的DNA片段较短（小于500bp），且插入片段没有影响LacZ基因的读框，此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。Q-3欲对克隆DNA片段进行测序时，使用何种引物？A-3本载体来源于pUC19载体。因此，用于pUC19载体测序的通用引物都可以使用。Q-4pMD19-TVector与pMD18-TVector相比有何不同？A-4pMD19-TVector与pMD18-TVector相比，β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。pMD18-TVector连接转化后，一般要经37℃过夜培养，然后再将其于冰箱内放置一段时间后，其蓝白菌落才能明显呈色。而pMD19-TVector涂板培养后一般只需10个小时（37℃）便可以呈色。因此，pMD19-TVector比pMD18-TVector更适合于蓝白菌落的筛选。NoteThisproductisforresearchuseonly.Itisnotintendedforuseintherape