siRNA讲座PPT

ThermoScientificDharmaconsiRNA产品特性臧有霞HelenZangBioscienceDivisionThermoFisherScientificThermoFisherScientific公司简介Theworldleaderinservingscienceƒ150年历史ƒ年销售额105亿美金ƒ全球34,000员工ƒ全球350,000客户ƒ遍布150个国家ƒ分析仪器设备ƒ分析试剂耗材ƒ软件ƒ客户服务等领域的领导者BiosciencesDivision•CellCulture•Hyclone•Genomics•Dharmacon•Abgene•OpenBiosystems•Finnzymes•Fermentas•Proteomics•Pierce•ABRantibodies•Cellomics•ChemicalDharmaconRNAiTechnologyRNA合成的世界领先者高效干扰siRNA的设计者siRNA干扰文库的倡导者RNAi基因组文库的发明者与世界顶级研究机构的合作者通过特定化学修饰提高干扰效率的革新者最全面的生物信息学算法和最多干扰参数的拥有者RNAi技术领域专利技术和知识产权最大的持有者应用Dharmacon技术在世界顶级杂志发表高水平文章最多的参与者5内容•简介RNAi•ThermoScientificDharmaconsiRNA产品特性•ThermoScientificDharmaconsiRNA产品简介6RNAi发展历史回顾Flies:RNAi1998Kennerdelletal.1998.Cell95:1017Hammondetal.2000.Nature404:293Zamoreetal.2000.Cell101:25Mammals:RNAi2001Elbashiretal.(2001)Nature411:494Fungi:quelling1992Romano(1992)MolMicro6:3343Plants:co-suppression1990Napolietal.1990.PlantCell2:279Worms:RNAi1998Fireetal.(1998)Nature391:8067Nature(1998)391:806AdaptedfromZamore(2002)Science,296:1265-1269.RNAi的发现CraigC.Mello(UMass)AndrewZ.Fire(StanfordU)TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine20068siRNA的结构SensestrandAnti-sensestrandCoreregionofthesiRNA(19nucleotideslong)Overhang(2nucleotideslong)9RNAi机制mRNAmRNAmRNA10miRNAsiRNAƒRNAi过程借用了天然的miRNA作用途径ƒmiRNA可以降解mRNA或抑制mRNA翻译成蛋白质RNAi机制11内容•简介RNAi•ThermoScientificDharmaconsiRNA产品特性•保证siRNA功能性的策略•保证siRNA特异性的策略•ThermoScientificDharmaconsiRNA产品简介12ThermoScientificDharmacon保证siRNA功能性的三大策略•生物信息学：SMARTselection™设计技术•混合技术：SMARTpool™技术•化学修饰：ON-TARGETplus™化学修饰技术13随机设计传统设计理性设计随机选取不考虑位点信息脱靶效应严重GC含量避开起始100bpAA（N19）TT参数有限，大量筛选BLAST检索….SMARTselectionTM大量序列热动力学参数生物信息分析独特的具有最小脱靶效应的功能性siRNA序列设计：SMARTselectionTM技术14only~20%ofrandomlyselectedsiRNAsknock-downtargetwithefficiency90%andhigher020406080100120随机设计ActivityofRandomlySelectedsiRNAs15SMARTselectionTM技术•Abiastowardslowinternalstabilityatthesensestrand3’-terminus•Lackofinvertedrepeats•OverallG/CcontentofsiRNAmolecule•BasepreferencesatspecificpositionsNatureBiotechnology(2004)22:326-33001020304050607080901000123456789108compoundalgorithmscoreSilencingefficiency8parameteralgorithm与基因沉默效果相关的siRNA特性提出siRNA设计经典的8大参数！16PublishedAlgorithm•8CriteriaimportantforFunctionality•DemonstrationofRationalDesignConcept01020304050607080901000123456789108compoundalgorithmscoreSilencingefficiency8parameteralgorithm0102030405060708090100020406080100SMARTscoreSilencingefficiency(medianof10)8+++parameteralgorithmAdvancedSMARTselection™design•Additionalparameters•Targetsequencesavoided•knownSNPs•highlyredundantsequences•highlyhomologoussequencesSMARTselectionTM技术我们应用更多的参数为您设计高功能性的siRNA！17SMARTpool™技术SMARTpool®Technology针对同一mRNA的不同区域设计4条不同的siRNA18SMARTpool™技术:保证siRNA的高功能性TargetmRNAAAAAA19SMARTselectionTMSMARTpool®ON-TARGETplusTM高功能的siRNA保证siRNA功能性20siRNA功能性vs.特异性•功能性和特异性是两个不同的方面:•功能性指的是一种siRNA沉默其靶基因的能力如：1号siRNA将基因X的表达敲低了80%…•特异性指的是一种siRNA能够沉默多少种基因（非靶基因）的表达如：1号siRNA沉默了基因X的表达，但是也同时将其它非靶基因（ABCD)的表达沉默了…StrictlyCompanyConfidential21RNAi实验相关的特异性和非特异性效应siRNARNAi-related(off-targeting)Lipid/siRNAUnrelatedtoRNAiLipidBackgroundRNATruegeneknockdownsignature22AdaptedfromJacksonetal.,(2003)NatureBiotechnology,21:635-638.功能性检测脱靶能力检测功能性≠特异性0.20.80.60.401.0FractionMAPK14remainingproteinRNA高功能性的siRNA并非都是特异的……23•分析了300随机设计的siRNA•其靶基因均对细胞生存无影响•分析条件均为已达到最优化结果：•25%显示出对细胞生存的“毒性”功能02040608010012011121314151617181910204060801001201112131415161718191101111121131141151161171181191201211221231241251261271281291大约25%siRNA产生了错误的表型推断(导致细胞死亡功能表型)AdaptedfromFedorovetal.,(2006)RNA,12:1188脱靶效应导致实验中的错误表型…24•脱靶效应:•潜在的毒性•不一致的表型(假阳性)所有的siRNA均能够有效的敲低同一基因表达（80%）脱靶效应导致实验中的错误表型…表型？？？25必须增强siRNA特异性针对脱靶效应产生的原因，采用有效的技术手段，增强siRNA的特异性，消除脱靶效应，在siRNA的应用中是至关重要的。脱靶效应导致可以检测到的生物学效应，产生假阳性，干扰实验结果。严重的阻碍了siRNA在研究和治疗中的应用。•脱靶效应的危害性——阻碍siRNA应用的瓶颈•降低脱靶效应——siRNA应用的重中之重26增强特异性的策略•生物信息学:SMARTselection™设计技术•链偏好性•Seedregion区过滤•Seed频率性分析•化学修饰:ON-TARGETplus™化学修饰技术•混合技术：SMARTpool™技术27链偏好性（Strandbias）•siRNA是对称的，RISC对双链处理程序相同。•如果反义链与RISC结合:因为反义链与靶mRNA是互补的，所以会找到正确的靶基因进行敲低。•如果正义链与RISC结合:因为正义链同样有可能能够结合某些mRNA（非靶mRNA），所以正义链结合后引起的基因沉默导致了脱靶效应。28链偏好性:定向的siRNA结合过程Strandbias:使RISC只结合siRNA的反义链。•如何做到?•如果RNA双链的末端GC含量较高，则不利于RISC解链。•设计标准:•反义链的5‘端多利用A/U,3'端多利用G/C29链偏好性：利用链偏好性进行设计•防止正义链进入RISC，导致脱靶效应的方法是:好的设计否:采用ON-TARGET®修饰FunctionalsiRNAsandmiRNAsExhibitStrandBiasKhvorovaA,etal.Cell(2003)115:209-216SMARTselectionTM设计包括链偏好性参数:在保证功能性的前提下，是否能在反义链的5‘端多利用A/U,3’端多利用G/C？30AAAAAAAAtargetmRNA5’3’3’5’5’-UTR3’-UTRAUGUAAseedregionORFNature(2005)433:769miRNA能够下调多个靶基因的表达miRNA生物信息学—Seedregion•miRNA通过Seedregion与mRNA3’UTR相互作用•在反义链的2-7或2-8区•也称为六聚体或七聚体区•miRNA不需要与靶mRNA完全互补LimLPetal.(2005)Nature433:76931BirminghamAetal.(2006)NatureMethods3:199-204解释siRNA引起脱靶效应的第一个模型SeedRegion会导致脱靶效应！生物信息学32生物信息学:seed频率与siRNA特异性的关系ExperimentalvalidationoftheimportanceofseedcomplementfrequencytosiRNAspecificityAndersonE,etal.RNA200814:853-861•ThermoFisherScientific是第一个在实验中证明seed区的频率与脱靶效应相关•在设计中考虑到seed区对siRNA特异性的影响。33生物信息学:Seedregion过滤及频率分析BirminghamAetal.(2006)NatureMethods3:199-204.WeeliminatesiRNAdesignswithseedsthatare100%conservedinhuman,mouse,andratmiRNAsExperimentalvalidationoftheimportanceofs