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1/7SMARTer®RACE5’/3’KitProtocol-At-A-GlanceCodeNo.634858/634859使用本Protocol-At-A-Glance前，请阅读试剂盒完整版使用操作手册。为了方便您的使用，我们提供了该精简版protocol，但不建议第一次操作者使用。2/7一、引物设计基因特异性引物（GSPs）应符合下列要求：长度为23–28nt，以保证特异性退火GC含量在50–70%之间Tm≥65°C;如果Tm大于70°C，这样可以使用touchdownPCR方法，获得最好的结果。Tm的计算基于基因特异性引物3‘末端而不是整条引物。与UniversalPrimerMix的3’端不互补。Longprimer=5’–CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT–3'Shortprimer=5’–CTAATACGACTCACTATAGGGC–3’与目的基因特异性互补与载体5’端有15个碱基的重叠(例如,在GSPs序列5’端增加序列“GATTACGCCAAGCTT”，细节如下)二、生成RACE-ReadycDNA1.按下列体积配制BufferMix用于cDNA合成反应。为保证体积量充足，请额外多配制1个反应的量。混合下列试剂，在微型离心机上短暂旋转，室温放置，用于第6步实验。2.在单独的微量离心管tube中加入下列试剂：*对照实验请加入1μl的ControlMouseHeartTotalRNA(1μg/μl)3.混合组分，在微型离心机上短暂旋转。4.72℃孵育3min，42℃冷却2min。冷却后，14,000xg下离心10sec，把试剂收集在管底。NOTE：该步骤可以在thermalcycler中进行。在孵育tube的同时，可以准备3/7第6步的混合液。5.为了补齐5‘RACEcDNA合成反应液，每个反应添加1μl的SMARTerIIAOIigonucleotide。6.按下列体积配制5‘RACE和3‘RACEcDNA合成反应液。室温下按下列顺序混合：7.取第6步的MasterMix8μl，加入到第4步的变性RNA（3’RACEcDNA）或第5步的变性RNA（5’RACEcDNA）中。每个cDNA合成反应的总体积为20μl。8.轻柔吸打混匀，短暂离心收集组分于管底。9.在空气孵育箱或热盖thermalcycler中，42℃孵育90min。10.70℃加热10min。11.使用Tricine-EDTABuffer稀释第一链cDNA合成反应产物：如果起始totalRNA200ng，添加10μl；如果起始totalRNA200ng，添加90μl；如果起始使用polyA+RNA，添加240μl。12.现在得到了可用于3’RACE-readycDNA和5’RACE-readycDNA。该cDNA样本-20℃下最多保存三个月。三、RapidAmplificationofcDNAEnds(RACE)下面是5’-RACEPCR和3’-RACEPCR反应，产物为5’cDNA和3’cDNA片段。我们推荐您使用TFR引物和UPM做5’-RACE和3’-RACE阳性对照反应。尽管试剂盒附带了UniversalPrimerShort(UPMshort)，但SMARTerRACE反应并不是必须要做巢式PCR的。1.按下列体积配制PCRMasterMix。请额外多加一个反应的量，以保证有足够的体积。5’-RACE和3’-RACE可以使用相同的MasterMix。每50μlPCR体系，按下列体积混合试剂：4/72.按下表配制PCR反应液。按下面顺序把各组分加入到0.5mlPCRtubes中，轻柔混匀。3.采用下列PCR程序之一来进行热循环（阳性对照TFR和UPM引物使用程序1和2都可以）。请根据起始是polyA+还是totalRNA来设置合适的循环数。NOTESONCYCLING:或许需要根据经验确定您的基因的最佳循环参数，因为循环圈数取决于目的转录子的丰度。最佳延伸时间取决于目的扩增子的长度。长度为0.2–2kb的扩增子,一般延伸2minutes;长度为2–4kb的扩增子,延伸3minutes;长度为5–10kb的扩增子,延伸10minutes.NOTE:Tm应该根据基因特异性引物的3’末端来计算，而不是整条引物。Program1(如果基因特异性引物Tm70°C，请优先选择touchdownPCR)*如果预计片段大于3kb，则每多1kb时间设置增加1minProgram2(如果基因特异性引物Tm=60–70°C请选择)*如果预计片段大于3kb，则每多1kb时间设置增加1min5/7四、RACE产物的确认和鉴定(一)使用NuceloSpinGelandPCRClean-UpKit进行胶纯化试剂盒附带的NuceloSpinGelandPCRClean-UpKit的更多相关资料，请在网站下载UserManual。开始操作前:向WashBufferNT3中添加96–100%乙醇24ml。请在瓶子的标签上做标记表示已添加乙醇。WashBufferNT3在室温下(18–25°C)至少一年内可保持稳定。1.对RACEDNA样品进行EtBr琼脂糖凝胶电泳。我们推荐使用TAE(40mMTris-acetate[pH8],1mMEDTA)或TBE(45mMTris-borate[pH8],1mMEDTA)buffer体系。2.在UV灯下对你的片段定位。使用干净的手术刀或刀片操作，切下片段，尽量少取到周围的琼脂糖，估计凝胶片上DNA的量。NOTE:尽量减少暴露在UV下的时间，以避免DNA损伤。3.测量凝胶片的重量，并转移至1.5ml微量离心tube中。4.每100mg凝胶，添加200μlBufferNTI。5.50°C下孵育5-10min，每2-3min进行vortex震荡直到凝胶片完全融解。6.把一个NucleoSpinGelandPCRClean-UpColumn放置到CollectionTube(2ml)上，上样700μl。11,000xg离心30秒。弃滤液。把柱子重新放置到collectiontube上。如果需要，把剩下的样品上样，重复离心操作。7.加入700μlBufferNT3到柱子上。11,000xg离心30秒。弃滤液。把柱子重新放置到collectiontube上。8.11,000xg离心1分钟，完全弃去BufferNT3。确保在从离心管和collectiontube中除去滤液的过程中吸附柱没有与滤液接触。NOTE:BufferNT3中残留的乙醇可能会抑制酶反应。在洗脱(Step9)前，70°C孵育柱子2-5分钟可使乙醇完全去除。9.把柱子放置到一个新的1.5ml微量离心管中（试剂盒中不附带）。加入15μl–30μlBufferNE，室温(18–25°C)下孵育1min。11,000xg离心1分钟来洗脱DNA。NOTE:使用新鲜的buffer，加热至70℃，孵育5分钟，进行多次洗脱，可以增加大片段DNA(1000bp)的回收。6/7(二)RACE产物的In-Fusion克隆了解试剂盒中附带的In-FusionHDCloningKit的更多相关信息请下载UserManual。1.混合下列组分。LineareizedpRACEvector（试剂盒附带组分）1μl胶纯化后的RACE产物7μlIn-FusionHDMasterMix2μl总体积10μl2.50℃孵育15分钟后转移至冰上。3.按照StellarCompetentCells的Protocol，取2.5μl反应液转化StellarCompetentCells。IMPORTANT:不要向50μl感受态细胞中加入超过5μl的反应液。不是越多越好，太多的反应液会抑制转化。4.把转化液的1/100–1/5放入单独的tube中，并加入SOCmedium至100μl。涂板，每份稀释后的转化液涂在含有100μg/mlampicillin的LB板上。5.每份转化液的剩余部分6,000rpm离心5分钟弃上清，重悬沉淀于100μl新鲜SOC培养基。涂在含有适量抗生素的平板上。37°C过夜。6.第二天，从每个实验平板上挑取单菌落，根据产品操作步骤提质粒。通过使用基因特异性引物进行PCR筛选，或限制酶酶切来分析DNA（可以使用克隆位点两侧的EcoRI和HindIII），来确定RACE产物是否插入，。NOTE:对于5’-RACE产物，我们推荐至少挑8-10不同的独立克隆，来得到最大量的5’末端序列。(三)RACE产物测序一旦你确认了含有最大基因特异性插入的克隆，尽可能获取最多的序列。理想中，你可以分析整个阅读框，以及5’和3’非翻译区域。NOTE:附带的pRACEvector是基于pUC19载体改造的载体，可使用M13测序引物来确认你的克隆插入。因为In-FusionCloning有方向性的，可以优先使用M13F引物测序UPM端，用M13R来测序基因特异性端。UPM包含T7priming位点，可以用于Sanger测序,但我们推荐使用M13引物来得到你实验序列的全部reads。T7引物位点距离5’和3’克隆位点太近了，不能保证得到测序底物中全部的序列。合成全长cDNA的方法的选择通过部分测序或完整测序来确定RACE产物之后，可以采取下列方法之一来生成全长cDNA：7/7在你的cDNA的5’和3’最末端设计引物，使用5’-RACE-ReadycDNA做模板，进行longdistancePCR(LDPCR)；利用5’-RACE和3’-RACE片段重叠部分的酶切位点，克隆重叠片段。如果没有合适的酶切位点，也可以选择设计新的GSP，进行多片段In-Fusion克隆。NOTE:In-Fusion方法进行多片段克隆的细节请参考网站technoteIn-FusionMultipleFragmentCloning.翻译来自于“SMARTerRACE5'3'KitProtocol-At-A-Glance_032514”