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第5讲DNA和蛋白质技术1．提取原理DNA与杂质的溶解度不同，DNA与杂质对酶、高温、洗涤剂的不同。2．实验设计(1)材料的选取：选用DNA含量相对的生物组织，如鸡血、菜花、洋葱等。(2)破碎细胞(以鸡血为例)：鸡血细胞液，加，用搅拌，用过滤，收集滤液。(3)去除杂质：利用DNA在不同浓度的中溶解度不同，通过控制的浓度去除杂质。(4)DNA析出：将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的(体积分数为95%)。3．DNA的鉴定将DNA溶解在2mol/L的NaCl溶液中，加入4mL的，沸水中加热5min，溶液变成蓝色。耐受性较高蒸馏水玻璃棒纱布NaCl溶液溶液酒精溶液二苯胺试剂1．PCR原理DNA的。2．PCR反应过程(1)变性：当温度上升到以上时，双链DNA解聚为。(2)复性：温度下降到时，两种通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。(3)延伸：温度上升到时，溶液中的4种脱氧核苷酸(A，T，C，G)在的作用下，根据碱基互补配对原则合成新DNA链。热变性90℃单链50℃左右引物72℃DNA聚合酶1．凝胶色谱法是根据蛋白质相对分子质量的大小分离蛋白质(√)2．用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量小的蛋白质先分离出来(×)【提示】相对分子质量大的蛋白质先分离出来。3．电泳法分离蛋白质是根据蛋白质的带电性质、大小及形状不同，在电场中迁移的速度不同而实现分离(√)4．用透析法可以除去样品中分子量较大的杂质(×)【提示】除去的是分子量较小的杂质。1.基本原理(1)血细胞在蒸馏水中易吸水而导致细胞膜和核膜的破裂，据此可得含核DNA的溶液。(2)DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，在0.14mol/L的NaCl溶液中溶解度最低。(3)DNA不溶于酒精溶液；不被蛋白酶所水解；可被二苯胺染成蓝色。1.PCR原理在一定的缓冲溶液中通过控制温度并提供模板和原料，使DNA复制在体外反复进行。2．PCR反应过程(1)变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，如下图：(2)复性：温度下降至50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：(3)延伸：当温度上升至72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：3．结果(1)PCR一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、复性、延伸三步。(2)两个引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。说明：DNA复制需要引物的原因：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3′端延伸DNA链。2.实验操作程序(1)样品处理①红细胞的洗涤：除去杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化；②血红蛋白的释放：使红细胞破裂，血红蛋白释放出来；③分离血红蛋白溶液：经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。(2)粗分离——透析：除去样品中相对分子质量较小的杂质。(3)纯化：一般采用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离和纯化。(4)纯度鉴定：一般用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法来测定蛋白质的分子量，即对血红蛋白进行纯度鉴定。说明：相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，而相对分子质量较大的蛋白质只能在凝胶外部移动，移动速度快，因此蛋白质分子彼此分离。考向蛋白质的提取和分离1．本考点近三年命题较少，仅有2011年广东高考T5,2009年广东高考T38，考查了蛋白质提取与分离的原理。2．预计2013年高考可能会将蛋白质的提取和分离与其他物质的提取和分离进行综合考查。(2012·太原模拟)试回答下列“蛋白质提取与分离实验”和“叶绿体中色素提取和分离实验”的有关问题：(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂质蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是__________。(2)若要去除血清蛋白中的小分子杂质，采用图1装置。透析液是__________，一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色？__________，判断的依据：__________。(3)色素分离时采用的层析液是__________。(4)图2、图3分别表示电泳法分离蛋白质和纸层析法分离叶绿体中色素的结果。不同蛋白质得以分离是因为__________；不同色素得以分离是因为_____；条带c呈_________色；条带d表示__________色素。【解析】(1)为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂质蛋白，洗涤时应使用生理盐水，因为使用蒸馏水会导致红细胞吸水破裂。(2)若要去除血清蛋白中的小分子杂质，可以采用透析的方法，透析液是(磷酸)缓冲液，这样可以防止蛋白质变性，一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液会出现紫色，因为双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血清蛋白质反应，生成紫色物质。(3)色素分离时采用的层析液是石油醚，因为色素在石油醚中溶解度比较大。图2表示电泳法分离蛋白质的结果，其分离的根据就是不同蛋白质所带电荷性质、分子大小和形状不同，导致电泳时迁移速度不同。图3表示纸层析法分离叶绿体中色素的结果，其分离的根据就是不同色素在层析液中溶解度不同，导致层析时扩散速度不同。根据色素分离的结果，最上面的条带c是叶绿素b，呈黄绿色，最下面的条带d是胡萝卜素。【答案】(1)防止红细胞吸水破裂(2)(磷酸)缓冲液出现紫色双缩脲试剂可以透过半透膜，与袋内血清蛋白质反应，生成紫色物质(3)石油醚(4)不同蛋白质所带电荷性质、分子大小和形状不同，导致电泳时迁移速度不同不同色素在层析液中溶解度不同，导致层析时扩散速度不同黄绿胡萝卜素1．(2011·江苏高考)在利用鸡血进行“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，相关叙述正确的是()A．用蒸馏水将NaCl溶液浓度调至0.14mol/L，滤去析出物B．调节NaCl溶液浓度或加入木瓜蛋白酶，都可以去除部分杂质C．将丝状物溶解在2mol/LNaCl溶液中，加入二苯胺试剂即呈蓝色D．用菜花替代鸡血作为实验材料，其实验操作步骤相同【解析】本题考查“DNA的粗提取和鉴定”实验中的操作要点及试剂、材料的选择等，意在考查考生的实验分析能力。A项，在0.14mol/L的NaCl溶液中DNA的溶解度最低，DNA在析出物中，故析出物不能丢弃；B项，利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分；C项，DNA鉴定时加入二苯胺试剂后还需经沸水浴才能出现蓝色；D项，用菜花作为实验材料时需要加入一定量的洗涤剂和食盐，进行充分搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。【答案】B2．(2011·广东高考)以下关于猪血红蛋白提纯的描述，不正确的是()A．洗涤红细胞时，使用生理盐水可防止红细胞破裂B．猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少C．血红蛋白的颜色可用于凝胶色谱法分离过程的监测D．在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比分子量较小的杂蛋白移动慢【解析】D项考查凝胶色谱法分离蛋白质的原理，相对分子质量越大的通过凝胶色谱柱的速度越快，故D错误。A正确，生理盐水为猪体细胞的等渗溶液，所以在洗涤红细胞时，使用生理盐水可维持细胞的正常形态。B正确，哺乳动物成熟的红细胞没有细胞核与众多的细胞器，提纯时杂蛋白较少。C正确，血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液(如果操作都正确，能清楚的看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出)，这使得血红蛋白的分离过程非常直观，简化了操作。【答案】D3．(2012·苏州模拟)下图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有__________功能。(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是__________；乙装置中，C溶液的作用是__________。(3)甲装置用于__________，目的是__________。用乙装置分离蛋白质的方法叫__________，是根据__________分离蛋白质的有效方法。(4)用乙装置分离血红蛋白时，待__________时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。【答案】(1)运输(2)磷酸缓冲液洗脱血红蛋白(3)透析(粗分离)去除样品中分子量较小的杂质凝胶色谱法相对分子质量的大小(4)红色的蛋白质接近色谱柱底端4．(2011·南通模拟)下图是“DNA粗提取与鉴定”相关实验步骤，请据图分析回答：(1)鸡血细胞是进行该实验较好的实验材料，这是因为鸡血细胞核中__________，材料易得，以及鸡血细胞极易__________。从鸡血细胞中释放出核物质的处理方法是______________________________。(2)图a表示释放该物质后进行过滤的过程，过滤后取________进行下一步实验。(3)图b表示的相关操作过程中，加入2mol/LNaCl溶液的作用是________。(4)图c表示在滤液中加入冷却的95%的酒精，其目的是__________。【解析】(1)鸡血细胞中DNA含量高，让鸡血细胞在蒸馏水中吸水涨破可释放出核物质。(2)a过程的过滤滤出鸡血红细胞膜等，核物质含在滤液中。(3)在2mol/L的NaCl溶液中DNA溶解，蛋白质析出。(4)冷却的95%酒精可让DNA析出。【答案】(1)DNA含量丰富吸水涨破向鸡血细胞液中加入蒸馏水，并搅拌(2)滤液(3)溶解DNA分子(4)提取杂质更少DNA(或去除脂溶性杂质)