Western-Blot详解及问题分析

蛋白质免疫印迹技术及常见问题分析张绍进WesternBlotWesternBlot简介WesternBlot一般流程WesternBlot常见问题分析WesternBlotWesternBlot简介：印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法。WesternBlotWesternBlot基本原理WesternBlotWesternBlot优点高分辨率的电泳技术特异敏感的抗原-抗体反应1-5ng中等大小的靶蛋白WesternBlotWesternBlot应用目的蛋白的表达特性分析目的蛋白与其它蛋白的互作目的蛋白的组织定位目的蛋白的表达量分析WesternBlotWesternBlot流程蛋白样品的制备•SDS-PAGE•转膜•封闭•一抗杂交•二抗杂交•底物显色WesternBlot通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白水溶液提取法针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂。有机溶剂提取法对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。通过层析或电洗脱法制备目的蛋白蛋白样品的提取WesternBlot蛋白样品的定量目前常用比色法测定样品蛋白的含量：Bradford法（考马斯亮蓝法）、Lowry法（Folin-酚试剂法）、BCA法等。但各有优缺点，大家可以根据具体情况选取。按相应蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。蛋白质浓度测定的各种方法汇总：蛋白样品的变性2×SDS-PAGE上样缓冲液：DTT可临用前以1：4比例混合加入，亦可全部配好分装，-20℃冻存。按1:1比例与蛋白质样品混合，95～100℃加热5～15min，冰上冷却后再上样，上样量一般为20-25μl，总蛋白量20～50μg。1MTris-HCl(pH6.8)10ml1MDTT20mlSDS4g甘油20ml溴酚蓝0.2g总体积100ml①100mMTris-HCl(pH6.8)②200mMDTT③4%SDS④0.2%溴酚兰⑤20%甘油⑥ddH2OWesternBlotSDS：阴离子去污剂变性剂氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不同分子之间原有的电荷差异。与强还原剂一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。WesternBlot蛋白质-SDS胶束的特点：（1）具有相同的形状，形状像一个长椭圆棒（2）平均1g蛋白质结合1.4gSDS（3）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS胶束基本上是相同的（4）长轴的长度则与亚基分子量的大小成正比WesternBlot不连续的电泳缓冲体系。SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于蛋白质分子量的大小。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳WesternBlotSDS-PAGE是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二硫键破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。蛋白质分子结合SDS阴离子后，所带负电荷的量远远超过了它原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量，而与其所带电荷的性质无关。【SDS-PAGE基本原理】WesternBlot凝胶成分丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺SDS配胶的Tris缓冲液TEMED过硫酸铵Tris-甘氨酸电泳缓冲液WesternBlotPAGE：聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel)是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。化学惰性强，具有一定的机械强度和透明度。是良好的电泳介质。WesternBlot聚丙烯酰胺凝胶的聚合方式：•单体：丙烯酰胺（Acr）；•交联剂：甲叉双丙烯酰胺（Bis）；•催化剂：过硫酸胺或核黄素（AP）；•加速剂：四甲基乙二胺（TEMED）；•产物：三维网状结构凝胶•聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基(freeradicals)的催化，使体系发生氧化还原作用(catalyst-redoxsystems)来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化（核黄素——TMTED）体系。WesternBlot凝胶浓度与蛋白分离范围凝胶浓度（％）线性分离范围（KD)1512-431016-687.536-945.057-212SDS-PAGE浓缩胶(5%Acrylamide)及分离胶配方表：不连续电泳：作用缓冲液PH凝胶浓度浓缩胶使蛋白样品浓缩pH6.8Tris-Cl低，2-5%分离胶使蛋白样品分离pH8.8Tris-Cl高，根据蛋白大小电泳缓冲液：pH8.3Tris-甘氨酸系统。WesternBlot灌制分离胶隔绝空气ddH2O0.1%SDS:8%异丁醇：8%WesternBlot灌制积层胶插入梳子WesternBlotStakinggelSeparatinggelWesternBlot转膜要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上，通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。常用的电泳转移方法有湿转和半干转。两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。WesternBlot转移膜的选择最常用于WesternBlot的转移膜主要是硝酸纤维素（Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯（PolyvinylideneFluoride,PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。各种膜的详细特点介绍：湿转系统WesternBlot半干转移系统WesternBlot丽春红染色蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。印度墨汁染色只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。转膜后检测（此步可以省略）WesternBlot封闭为避免作为检测试剂的特异性第一抗体与膜发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对膜上的潜在结合位点进行封闭处理。5%脱脂奶粉或BSA（室温孵育1h）WesternBlot膜封闭液（生物试剂公司）Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。WesternBlot一抗、二抗孵育把NC膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据膜面积以0.1mL/cm2的量加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育1-2小时或4℃过夜。回收一抗溶液，用TBST漂洗膜3次，每次10min。最后用TBS漂洗膜2次，每次10min。WesternBlot二抗与底物反应显色•辣根过氧化物酶法（HRP）•碱性磷酸酶法（AP）•化学发光显色法(HRP)WesternBlot膜解吸方法（膜的重复利用）通过加热和去污剂进行解吸原理：组合使用去污剂和加热使抗体解离，适用于任何化学发光底物系统。酸解吸原理：使用低pH改变抗体结构从而使结合位点失活，从而将抗体与抗原分离，适用于任何化学发光底物系统。WesternBlotWesternBlot结果分析目的蛋白的灰度值除以内参的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。WesternBlot结果分析软件Gel-ProAnalyzer4绿色版（附动画演示教程）常见问题分析WesternBlotSDS-PAGE电泳胶不平？凝胶漏液？胶板洗刷干净加入AP和TEMED的量要合适加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀两块玻璃板底部要对齐WesternBlot条带比正常的窄？“微笑”或“倒微笑”条带？凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电泳槽装置是否合适SDS-PAGE电泳WesternBlot转膜及抗体检测凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓冲液过热？可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸确保膜和胶块之间没有气泡缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温WesternBlot转移到膜上的蛋白很少1.蛋白分子量10KD2.蛋白的等电点93.SDS浓度不合适4.凝胶太厚原因对策1.蛋白分子量10KD时，减少转膜时间；使用小孔径的膜2.更换高pH值Buffer3.在阴极buffer中加入0.005-0.01%SDS可提高转膜效率4.延长转膜时间WesternBlot1.膜没有均匀浸湿2.膜或者缓冲液污染3.封闭不充分4.抗体与封闭剂出现交叉反应5.抗体浓度过高原因对策1.转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿2.拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液3.检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应4.杂交前检测一抗、二抗的工作浓度背景太高WesternBlot杂交信号很弱1.抗体保存不当2.抗原不充足3.膜的漂洗过度原因对策1.抗体长期保存应在－70℃，使用前做效价检测2.增加蛋白上样量，做已知标准量蛋白的对照3.减少漂洗的时间和次数WesternBlot1.一抗不是唯一特异的2.二抗出现非特异结合原因对策1.制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点2.设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合出现非特异带WesternBlotFurtherReadings生物秀WesternBlotting专题Millipore的蛋白印迹手册Bio-Rad的westernBlotting操作手册Westernblot问题解答专帖