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食物中维生素B6的测定方法微生物法1.原理维生素B6在酸性介质中对热比较稳定，但在碱性介质中对热不稳定。测量维生素B6比较经典的方法是微生物法它的优点是：1.特异性高、精密度好、操作简单（不需要特殊设备，易于推广，样品不需要进行一系列的提纯步骤）、准确度高。它的缺点是：耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。2.适用范围GB/T17407-1998，适用于药物、食物及饲料的检测3.仪器电热恒温培养箱电热手提式压力蒸汽消毒器液体快速混合器离心机722光栅分光光度计硬质玻璃试管4.试剂（1）0.22mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入12.32mlH2SO4，用水稀释至1000ml。（2）0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28mlH2SO4，用水稀释至1000ml。（3）10mol/L氢氧化钠：溶200gNaOH于水中，稀释至500ml。（4）0.1mol/L氢氧化钠：取10ml10mol/LNaOH，用水稀释至1000ml。（5）溴甲酚绿：0.04%溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250ml。（6）培养基：称取吡哆醇Y培养基5.3g，溶解于100ml蒸馏水中。（7）100ug/ml吡哆醇标准储备液：称取122mg盐酸吡哆醇标准溶于1L25%乙醇中，保存于4℃冰箱中，稳定1个月。（8）1ug/ml吡哆醇标准中间液：，取1ml吡哆醇标准储备液，稀释至100ml。（9）琼脂培养基：吡哆醇Y培养基5.3g，琼脂1.2g，稀释至100ml。（10）1.5MOL/l生理盐水：取9gNaCl溶于1000ml水中。5.菌种的制备与保存5.1储备菌种的制备与保存：以卡尔斯伯酵母菌ATCCNo.9080简称SC?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在30±0.5℃恒温箱中培养18-20小时，取出后置于冰箱中保存，至多不超过两星期。保存两周以上的菌种，不能立即用作制备接种用的种子液，一定要在使用前每天移种一次，连续2~3天，方可使用，否则生长不好。5.2种子培养液的制备：加0.5ml50ng/ml的VB6标准应用液于尖管中，加入5ml基本培养基，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内（高压锅）151b压力下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。6.操作步骤整个步骤要避光（1）样品制备：取样0.5~10g（VB6含量不超过10ng）放入100ml三角瓶中，加0.22mol/LH2SO472ml。放入高压蒸汽锅121℃下水解5个小时，取出，于水中冷却，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。（指示剂由黄-黄绿色），将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存滤液即样液于冰箱内备测定（保存期不超过36小时）。（2）接种液的制备：使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时接种两管，在30±0.5℃的恒温箱中培养18-20小时。取出离心10分钟（3000rpm）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10ml消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。3.样品标准曲线的测定：取标准储备液2ml稀释至200ml成为中间液，从中间液中取5ml稀释至100ml作为工作液，浓度为50ng/ml，3组试管各加0，0.02，0.04，0.08，0.12，和0.16ml工作液，再加5ml吡哆醇Y培养基，混匀，加棉塞。（3）试样的测定：在试管中分别加入0.05，0.10，0.20ml样液，再加入5ml吡哆醇Y培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121℃，15磅/英寸2）高压10min，冷至室温备用。（4）接种和培养：每管接种一滴接种液，于30±0.5℃恒温箱中培养18-22小时（5）测定：从恒温箱中取出后，用722分光光度计测量，用空白管调零。550nm波长下，测定各管的吸光度值，以标准管所含VB6的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制VB6标准工作曲线，用测定管得到的吸光度值，在标准曲线上查到测定管内所含VB6的量。7.计算各样管的吡哆醇含量A为：A（ng/ml）=（x1/V1+x2/V2+x3/V3）/3则样品的吡哆醇含量为：mg/100g=A×V×102/w×106=A×V/W×104每个样品各测定管的吡哆醇含量为x1，x2，x3；取液量分别为V1，V2，V3样品重W（g）取液量V（ml），定容至100ml8.注意事项（1）所有步骤需要避光处理（2）培养时每管必须在同一温度，培养时间以18-24hour为宜。（3）本实验所有用水皆采用蒸馏水。食品中维生素B6的测定【GB/T17407—1998】本标准方法系在参考了美国公职分析家协会分析方法手册（AOAC）公定分析方法及国外有关资料的基础上，经过系统研究而制定出来的。本方法特异性强、灵敏度高、不需特殊仪器，易于推广应用。本标准由中华人民共和国卫生部提出。本标准由中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所负责起草；青海省卫生防疫站和昆明医学院参加起草。本标准主要起草人：周瑞华、杨晓莉、王光亚。本标准由卫生部委托卫生部食品卫生监督检验所负责解释。1范围本标准规定了用微生物法测定食品中维生素B6的含量。本标准适用于各类食品中维生素B6的测定。2原理卡尔斯伯(SaccharomycesCarlsbrgensis)酵母菌需在有维生素B6存在的条件下才能生长，在一定条件下维生素B6的量与其生长呈正比关系。用比浊法测定该菌在样品液中生长的混浊度，与标准曲线相比较得出样品中维生素B6的含量。本方法检出限为0.1ng。3试剂和培养基本实验所用的水均为蒸馏水。所用的试剂均需分析纯。3.10.22mol/L硫酸溶液：取12.3mL相对密度为1.84的硫酸加水稀释至1000mL。3.24mol/L、1mol/L及0.1mol/L氢氧化钠溶液。3.325%(V/V)乙醇溶液。3.4维生素B6标准储备液(0.1mg/mL)：精确称取0.1220g经干燥恒重的盐酸吡哆醇标准品，用25%乙醇定容至1000mL。冰箱中保存。3.5维生素B6标准中间液(1.0μg/mL)：吸取5.00mL维生素B6标准储备液于500mL容量瓶中，用25%乙醇定容。冰箱中保存。3.6维生素B6标准应用液(50ng/mL)：临用时吸取5.00mL维生素B6标准中间液于100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。3.7琼脂3.8吡哆醇Y培养基(PyridoxineYmediumDifc00951－15－2)：称取5.3g吡哆醇Y培养基，用水稀释至100mL。用时现配。3.9琼脂培养基：称取5.3g吡哆醇Y培养基、1.2g琼脂于烧杯中，加入维生素B6标准中间液2mL(3.5)，加水至100mL，于水浴中加热溶解，趁热尽快分装入试管中，每管3～5mL，塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min。制成的斜面培养基，于4℃冰箱内保存。3.10生理盐水：称取0.9g氯化钠溶解于100mL水中。每次使用前，分别倒入2～4支15mL试管中，每支约10mL，塞上棉塞于121℃高压灭菌5min，备用。3.110.04%溴甲酚绿溶液：称取0.1g溴甲酚绿于小研钵中，加1.4mL0.1mol/L氢氧化钠研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释至250mL。4仪器和设备4.1实验室常用设备。4.2电热恒温培养箱。4.3压力蒸气消毒锅。4.4液体快速混合器。4.5离心机。4.6分光光度计。4.7耐热硬质玻璃试管：12mm(i.d)×160mm。5菌种与培养液的制备及保存5.1储备菌种的制备：以卡尔斯伯酵母菌纯菌种(SaccharomycesCarlsbrgensis中科院微生物所No.AS：2.1419)接入2～3支琼脂培养基管中，在30℃恒温箱中培养18～20h，取出，于冰箱中保存不超过两周。保存数周以上的储备菌种，不能立即做制备接种液用，必须在使用前每天移种一次，连续2～3次，才可使用。5.2种子培养液的制备：加5mL吡哆醇Y培养基及维生素B6标准应用液0.2mL(3.6)于试管中塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min，放冷，于冰箱中保存。每次制备2～4管备用。6操作步骤6.1种子液的制备：需无菌操作。用接种环从新鲜琼脂斜面培养基上取下卡尔斯伯酵母菌转种到种子培养液(5.2)中塞上棉塞，以45°倾斜度于30℃温度下培养18～20h，在1500r/min下离心5～10min，弃去上清液，用灭菌生理盐水洗菌种两次，再用灭菌盐水5mL稀释该菌种，使成混浊液，即接种液。6.2样品提取液的制备称取样品0.5～10g(维生素B6含量不超过10ng)放入100mL三角瓶中，加72mL0.22mol/L硫酸溶液，用瓷坩埚盖于瓶口，于121℃高压水解样品5h，取出冷却后，加约10mL4mol/L氢氧化钠，以滇甲酚绿作外指示剂，调节pH值至4.5(指示剂由蓝绿色变为黄绿色)。将三角瓶内容物移至100mL容量瓶中，加水定容至刻度，用滤纸过滤后，滤液于冰箱中保存备用(保存期不宜超过36h)。6.3样品试液管的制备每支试管中分别加入0.05，0.10，0.20mL的样品提取液，每个样品需做两组，再加入5mL吡哆醇Y培养基。6.4标准系列管的制备每支试管中分别加入维生素B6标准应用液0，0.02，0.04，0.08，0.12，0.16mL(相当于维生素B60，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0ng)，然后各加入5mL吡哆醇Y培养基。6.5灭菌样品管(6.3)和标准管(6.4)混匀后，塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min。6.6接种和培养待试管冷至室温后，在无菌条件下操作，用注射器在每支试管中接种一滴种子液，混匀后，于30℃温箱内培养18～20h。6.7测定将培养后的标准系列管和样品管，在液体快速混合器上混匀后立即测定混浊度。用分光光度计于550nm波长下以标准系列的空白管调零点，分别读取各管的光密度值。7计算以标准系列的含量(ng)为横坐标，以所对应的标准系列的光密度值为纵坐标，绘制标准曲线。用样品的光密度值在标准曲线上查出每管中维生素B6含量，再折算成每毫升样品中维生素B6含量。c＝(u1十u2十u3)/3………………………………(2)式中：X——样品中维生素B6的含量，mg/100g；c——样品提取液中维生素B6的浓度，ng/mL；μ——各样品测定管中维生素B6的浓度，ng/mL；V——样品提取液的定容总体积，mL；m——样品质量，g；100/106——折算成每100g样品中维生素B6毫克数。8结果的重复性同一实验室同时或连续2次测定结果相对偏差绝对值≤10%。GB/T5009.154-20035菌种与培养液的制备及保存5.1储备菌种的制备：以卡尔斯伯酵母菌纯菌种(SaccharomycesCarlsbrgensis中科院微生物所No.AS：2.1419)接入2～3支琼脂培养基管中，在30℃恒温箱中培养18～20h，取出，于冰箱中保存不超过两周。保存数周以上的储备菌种，不能立即做制备接种液用，必须在使用前每天移种一次，连续2～3次，才可使用。5.2种子培养液的制备：加5mL吡哆醇Y培养基及维生素B6标准应用液0.2mL(3.6)于试管中塞上棉塞，于121℃高压灭菌5min，放冷，于冰箱中保存。每次制备2～4管备用。6操作步骤5.2.2接种液的制备：需无菌操作。使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时制备两个管，以（45°倾斜度）于30℃温度下培养18～20h，在1500r/min下离心5～10min，弃去上清液，用灭菌生理盐水洗菌种两次，再用灭菌盐水5mL稀释该菌种，使成混浊液，即接种液。6.2样品提取液的制备称取样品0.5～10g(维生素B6含量不超过10ng)放入100mL三角瓶中，加72mL0.22mol/L硫酸