StepOne-培训手册

二零零八年八月StepOneTM荧光定量PCR检测系统培训手册1内容一、StepOneTM荧光定量PCR检测系统介绍二、系统安装条件三、培训所需试剂设备及样品四、培训程序及时间安排五、实验操作流程六、软件使用培训七、常见问题解答八、软件及主机常见问题处理2一、StepOneTM荧光定量PCR检测系统介绍1.1简介美国AppliedBiosystems公司拥有PCR以及定量PCR技术的双重专利，一直以来致力于PCR技术的开发和应用。StepOneTM是AppliedBiosystems公司推出的第四代荧光定量PCR检系统，这套系统除了秉承AppliedBiosystems公司荧光定量PCR仪一贯稳定的性能，以及精确、可靠的结果保证外，还配备了最新一代易于操作的定量分析软件，同时可以通过触摸屏实现对仪器的控制，使用者还可以通过远程网络进行仪器监控，这些功能，都使得荧光定量PCR实验变得前所未有的方便。正是得益与其高度灵活性和易用性，甚至对于先前从未有过实时定量PCR经验的科研人员来说，也非常有信心设置和操作StepOne扩增仪。2007年StepOneTM还获得了SelectScience评选的2007年度最佳生命科学新仪器奖。1.2专利的多组分算法荧光荧光定量过程要求每种荧光染料的真实荧光能够辨别区分，StepOneTM系统采用AppliedBiosystems公司专利的多组分算法，保证了检测装置能方便无荧光污染的进行检测。同时配备波长范围较宽的滤光片，可以收集更多的光信号，提高了信噪比和灵敏度。3图1-1：专利的多组分算法1.3光学模块StepOneTM采用蓝色高功率的光子发射二极管（LED）和高灵敏度的PDT来来激发和检测三种不同的光谱。LED由于是单一波长激发，荧光信号强，消耗低，稳定，寿命长，可以连续使用40年；PDT灵敏度高，逐一检测避免了样品间的荧光干扰。同时，StepOneTM独特的ROX参比染料提高了数据的精确性。图1-2：参比染料ROX均一化前后数据结果比较1.4PCR反应模式4StepOneTM使用一个加热模块，两种加热模式：标准循环模式和快速循环模式。快速循环模式可以在40分钟内完成40循环。更快的升降温，不仅缩短了反应时间，更有效地避免了非特异性结合，提高了PCR反应的特异性。StepOneTM系统支持10-30μl的反应体系，大大节省了实验损耗。图1-3：不同升降温体现不同的PCR反应特异性1.5PCR反应精确性StepOneTM不仅具有宽广的动力学范围（至少8个），而且精度很高。对于2倍差异模板的区分，可信度可以达到99.7%。StepOneTM荧光定量系统稳定，重复性很好。二．系统安装条件1.位置要求：稳定水平的操作平台放置设备，远离热源，避免阳光直射2.空间要求：操作平台尺寸（长×宽×高）：82.5×39.8×81.7cm3.重量：23.58Kg（此外，还需要有放置配套电脑的空间及载重）4.温度要求：15-30℃5.相对湿度：15％～80％，无冷凝6.电源：100-240VAC7.其它：通用插头接线板5三.培训所需试剂设备及样品设备耗材：1)台式离心机2)震荡混旋器3)移液器(10、20、200l规格)4)Eppendorf管，Tip头（带滤膜），乳胶手套等5)PCR反应管6)灭菌双蒸水以上物品请您提前准备妥当，基因公司培训人员将使用以上物品进行StepOne定量PCR仪的使用培训工作。使用试剂：上海晶泰生产“乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒”（基因公司提供）四、培训程序及时间安排（请至少安排2名实验室长期工作人员参加培训，以熟悉仪器操作并能负责仪器使用）培训时间安排(1天)：1)荧光定量PCR技术原理及应用讲座；2)StepOne系统技术特点讲解、仪器系统组成和工作原理讲解；3)仪器安装及使用培训；4)定量PCR演示实验；5)软件基本功能综述及使用培训五、实验操作流程一）、实验目的：验证机器的重复性、光路的均一性及了解机器和软件的使用及6其特点。二）、实验内容：标准曲线验证及重现性检测（三个完全相同的扩增体系实验）实验。使用试剂：用上海晶泰生产“乙型肝炎病毒（HBV）核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒”（基因公司提供）三）、仪器及耗材：移液器(10、20、200l规格)，0.1mlPCR光学反应管8个，eppendorf离心管（0.5ml）4个。四）、实验方法（探针法）:1)试剂准备：反应管数1N+1*混合液的准备HBVPCRMixHotStarTaq15μl0.2μl15μl*(N+1)0.2μl*(N+1)总的体积15.2μl91.2注：N为标准品数，1为阴性对照试剂使用前都混匀并低速离心。2)加样：将定量校准品（使用前先离心，再充分振荡混匀）各5μl分别加入反应管中，每个浓度设置三个重复，同时设置一管NTC（notemplatecontrol，即以水代替模板DNA），混匀后离心再置于StepOne定量PCR扩增仪上，立即进行PCR扩增反应（采用FAM通道检测荧光）。反应设置：热启动Taq酶50个循环95oC15分钟94oC10秒58oC10秒（收集荧光FAM）72oC10秒五）、实验结果:收集实验数据，分析对比实验结果六、软件使用培训以下是关于配套软件StepOneSystemVersion2.0的简要说明，便于初次使用者能够很快的熟悉掌握。7为了更好地诠释软件的使用，会按照不同的应用方向介绍：一、绝对定量方法在StepOne上的试剂操作一、仪器操作流程：1．开启电脑，打开StepOne软件2．创建新实验3．定义实验属性4．定义方法和材料5．设置靶目标6．设置标准品（选择）7．设置样本8．设置运行方法9．查看反应设置二、软件图标介绍：绝对定量在StepOne上的操作：8定义实验属性1．单击DesignWizard图标；2．单击ExperimentName字段，然后输入一个实验名称；3．选择Quantitation实验类型；4．点击Next；定义方法和材料1．单击StandardCurve；2．选择试剂类型；3．选择升降温模式；4．选择使用模板类型；5．点击Next定义靶目标1．输入靶目标数目；2．选择SetUpStandards；3．进行靶目标标准品的设置；4．输入靶目标的名称，选择荧光报告基团，荧光淬灭基团以及代表的相应颜色；5．点击Next设置标准品1．选择标准品浓度梯度数目；2．输入每个浓度梯度重复样本个数；3．单击EnterStartingQantity，输入拷贝数；4．选择标准品稀释比例；5．点击Next设置样本1．输入反应样本数目；2．输入每个反应样本重复个数；3．输入阴性对照重复样本个数；4．分别输入样本的名称；5．设置正确样本及其对应的靶目标；6．点击Next设置运行方法1．单击GraphicalView，输入反应体积；2．单击TabularView，输入正确的PCR反应体系，以及反应循环数；3．点击Next查看反应设置1.输入每个反应的体积以及额外补偿体积；2.选择合适的AssayType；3.根据自己PCR反应体系输入合适的各个反应试剂的体积；94.根据软件计算出的体积配置反应体系；5.输入标准品储存浓度，并根据软件计算出的体积配置各个标准品；6.点击FinishDesigningExperiment相对定量（标准曲线法）在StepOne上的操作：定义实验属性1.单击DesignWizard图标；2.单击ExperimentName字段，然后输入一个实验名称；3.选择Quantition实验类型；4.点击Next；定义方法和材料1．单击RelativeStandardCurve；2．选择试剂类型；3．选择升降温模式；4．选择使用模板类型；5．点击Next定义靶目标1．输入靶目标数目；2．选择SetUpStandards；3．进行靶目标标准品的设置；4．输入靶目标的名称，选择荧光报告基团，荧光淬灭基团以及代表的相应颜色；5．点击Next设置标准品1．选择标准品浓度梯度数目；2．输入每个浓度梯度重复样本个数；3．单击EnterStartingQantity，输入拷贝数；4．选择标准品稀释比例；5．点击Next设置样本1．输入反应样本数目；2．输入每个反应样本重复个数；3．输入阴性对照重复样本个数；4．分别输入样本的名称；5．设置正确样本及其对应的靶目标；6．点击Next设置运行方法1．单击GraphicalView，输入反应体积；2．单击TabularView，输入正确的PCR反应体系，以及反应循环数；103．点击Next内对照选择1．设定内对照查看反应设置1.输入每个反应的体积以及额外补偿体积；2.选择合适的AssayType；3.根据自己PCR反应体系输入合适的各个反应试剂的体积；4.根据软件计算出的体积配置反应体系；5.输入标准品储存浓度，并根据软件计算出的体积配置各个标准品；6.点击FinishDesigningExperiment相对定量（比较Ct值法）在StepOne上的操作：定义实验属性3．单击DesignWizard图标；4．单击ExperimentName字段，然后输入一个实验名称；3．选择Quantitation实验类型；4．点击Next；定义方法和材料1．单击ComparativeCt；2．选择试剂类型；3．选择升降温模式；4．选择使用模板类型；5．点击Next定义靶目标1．输入靶目标数目；2．输入靶目标的名称，选择荧光报告基团，荧光淬灭基团以及代表的相应颜色；3．点击Next设置样本1．输入反应样本数目；2．输入每个反应样本重复个数；3．输入阴性对照重复样本个数；4．分别输入样本的名称；5．设置正确样本及其对应的靶目标；6．点击Next内对照选择1．设定内对照11设置运行方法1．单击GraphicalView，输入反应体积；2．单击TabularView，输入正确的PCR反应体系，以及反应循环数；3．点击Next查看反应设置7.输入每个反应的体积以及额外补偿体积；8.选择合适的AssayType；9.根据自己PCR反应体系输入合适的各个反应试剂的体积；10.根据软件计算出的体积配置反应体系；11.输入标准品储存浓度，并根据软件计算出的体积配置各个标准品；12.点击FinishDesigningExperiment基因分型在StepOne上的操作：定义实验属性5．单击DesignWizard图标；6．单击ExperimentName字段，然后输入一个实验名称；3．选择Genotyping实验类型；4．点击Next；定义方法和材料1．选择试剂类型；2．点击Next定义靶目标1．输入靶SNP位点数目；2．输入靶SNP位点的名称，选择荧光报告基团，荧光淬灭基团以及代表的相应颜色；5．点击Next设置样本1．输入反应样本数目；2．输入每个反应样本重复个数；3．分别输入样本的名称；4．设置正确样本及其对应的靶目标；5．点击Next设置运行方法1．单击GraphicalView，输入反应体积；2．单击TabularView，输入正确的PCR反应体系，以及反应循环数；3．点击Next查看反应设置127.输入每个反应的体积以及额外补偿体积；8.选择合适的AssayType；9.根据自己PCR反应体系输入合适的各个反应试剂的体积；10.根据软件计算出的体积配置反应体系；11.输入标准品储存浓度，并根据软件计算出的体积配置各个标准品；12.点击FinishDesigningExperiment阴性/阳性分析在StepOne上的操作：定义实验属性7．单击DesignWizard图标；8．单击ExperimentName字段，然后输入一个实验名称；3．选择Presence/Absence实验类型；4．点击Next；定义靶目标1．输入靶目标名称；2．输入IPC的名称；3．点击Next设置样本1．输入反应样本数目；2．输入每个反应样本重复个数；3．输入对照（含有IPC）重复样本个数；4．输入对照（含有IPC抑制物）重复样本个数；5