6-昆虫基因工程

6昆虫基因工程历史事件1866年奥地利生物学家孟德尔发表论文“植物杂交试验”，提出了遗传学的分离定律、自由组合定律和遗传因子学说。1879年德国生物学家弗莱明发现细胞核内的染色体。1903年美国细胞学家萨顿发现了遗传因子与染色体的平行关系，提出了遗传的染色体学说。1915年美国生物学家摩尔根创立了现代遗传学的基因学说。1924年德国细胞学家福尔根发现了核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA）。1927年美国遗传学家缪勒发现X射线照射可人工诱使遗传基因发生突变。历史事件1929年俄裔美国生物化学家列文发现核酸碱基的主要成份是腺膘呤、鸟膘呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶。1938年美国生物学家、遗传学家比德尔与美国生物化学家塔特姆提出遗传基因通过一定的化学反应起作用的理论。1943年德裔美国生物学家、物理学家德尔布吕克，意大利裔美国生物学家卢里亚，美国遗传学家赫尔希合作发现了病毒的复制机制。1952年，他们又分别发现在上述复制机制中起决定性作用的遗传物质是DNA。1944年美国细菌学家艾弗里首次证明DNA是遗传信息的载体。1946年美国生物化学家塔特姆与美国遗传学家莱德伯格合作发现了两种细菌混合培养时发生了“杂交”现象，实现了基因重组。1948年挪威科学家弗伯格提出了DNA螺旋结构的结论。1951年美国女遗传学家麦克林托克提出了可移动的遗传基因（即“跳跃基因”）学说。三大物种内的昆虫基因工程果蝇系统发育生物学，P元件家蚕系统表达异源功能蛋白，病毒转染蚊虫和害虫系统改良物种，转座子转化1果蝇的基因转化系统历史回顾转座子的研究历史1951年,冷泉港生物学专题讨论会上,麦克林托克报告的新理论：遗传基因可以转移,能从染色体的一个位置跳到另一个位置,甚至从一条染色体跳到另一条染色体上.把这种能自发转移的遗传基因称为转座因子.转座因子除了具有跳动的特性之外,还具有控制其他其因开闭的作用,因此转座因子又可叫做控制因子.美国遗传学家巴巴拉.麦克林托克(B.McClintock)1果蝇的基因转化系统经典的染色体遗传学理论生物细胞内的遗传物质比较稳定,遗传基因以一定的顺序在染色体上作线性排列,彼此之间的距离也非常稳定.常规的交换和重组只发生在等位基因之间,并不扰乱这种距离。知识点回顾转座子(transposon,Tn)存在于染色体DNA上可自主复制和移位的基本单位.___最简单的转座子不含有任何宿主基因而常被称为插入序列(insertionsequence,IS),它们是细菌染色体或质粒DNA的正常组成部分.一个细菌细胞常带有少于10个IS序列.转座子常常被定位到特定的基因中,造成该基因突变.IS序列都是可以独立存在的单元,带有介导自身移动的蛋白.知识点回顾转座子的分类和结构特征复合式转座子(compositetransposon)一类带有某些抗药性基因(或其他宿主基因)的转座子,其两翼往往是两个相同或高度同源的IS序列,表明IS序列插入到某个功能基因两端时就可能产生复合转座子.一旦形成复合转座子,IS序列就不能再单独移动,因为它们的功能被修饰了,只能作为复合体移动.知识点回顾转座作用的机制转座时发生的插入作用就是受体分子中有一段很短的(3-12bp),被称为靶序列的DNA会被复制,使插入的转座子位于两个重复的靶序列之间.不同转座子的靶序列长度不同,但对于一个特定的转座子来说,它所复制的靶序列长度都是一样的,如IS1两翼总有9个碱基对的靶序列,而Tn3两端总有5bp的靶序列.知识点回顾转座作用的机制转座可被分为复制性和非复制性两大类.在复制性转座中,所移动和转位的是原转座子的拷贝.转座酶(transposase)和解离酶(resolvase)分别作用于原始转座子和复制转座子.TnA类转座主要是这种形式.在非复制性转座中,原始转座子作为一个可移动的实体直接被移位,IS序列,Mu及Tn5等都以这种方式进行转座.知识点回顾转座作用的遗传学效应①转座引起插入突变②转座产生新的基因③转座产生的染色体畸变④转座引起的生物进化.果蝇的转座子P因子FB因子Copia因子果蝇转座元件P元件的结构与特征结构属于一个家族，含有31bp的末端反向重复序列。转座时在靶DNA上产生8bp的正向重复序列，不同的P元件所含有的开放阅读框数量不同。特征P元件转座能力的激活具有组织特异性，只发生在生殖细胞中，但是P元件中转座酶的的编码序列却是在生殖细胞中和体细胞中都能转录。果蝇转座元件P元件的结构与特征P元件转座能力激活的组织特异性（图6-2）体细胞内剪切模式只有前两个内含子被切除，形成一个ORF0-ORF1-ORF2的编码区，获得66kD的蛋白质是P元件转座活性的阻遏物生殖细胞内剪切模式可和在体细胞内的剪切模式相同，也可把3个内含子全部切除，从而连接4个阅读框，形成的mRNA被翻译成87kD的转座酶，转座酶首先与靠近31bp末端反向重复序列的一个10bp序列结合，然后通过一种非复制型的方式进行转座。P元件介导的果蝇杂交不育参考图6-3杂交不育的原因基因突变，染色体畸形，减数分裂异常P元件介导的杂交不育的结果P元件介导的果蝇经典转化程序经典实验的验证1982年，A.C.Spradling和G.M.Rubin,结论若质粒含有P元件，将该质粒注射到果蝇M型雌性果蝇的胚胎中，可实现基因转移P元件介导的果蝇经典转化程序P元件介导的果蝇转化条件1受体细胞内存在转座酶2存在反向重复序列及其邻近的亚末端序列思考：是否可以利用P元件介导进入果蝇的特征研究转移载体？如何设计？P元件介导的果蝇经典转化程序分析1完整的P元件最长达到29kb,是否会增加转化的难度？2转座酶是否一定要依靠P元件转录翻译来提供？3P元件转座作用有何利用价值？P元件介导的果蝇经典转化程序穿梭质粒的构建条件1大肠杆菌复制子结构2选择性标记基因（果蝇一般用黄嘌呤脱氢酶[rosy]基因）3P元件末端外侧的反向重复序列4一个或多个限制性酶切位点思考：转座子载体的开发与应用？P元件介导的果蝇经典转化程序操作程序参见图6-4P3042蚊虫和农业害虫的基因改造系统害虫的治理杀虫剂---------对环境造成不可逆的污染转基因植物----食品安全性的担忧分子遗传学家的设想昆虫不育技术，“以虫治虫”2.1用于非果蝇类昆虫转化的载体2.1.1用于非果蝇类昆虫转化的转座元件MinosMarinerHermespiggyBac参见表6-1和6-2（可转化15个昆虫种）2.1用于非果蝇类昆虫转化的载体2.1.2用于非果蝇类昆虫转染的病毒转座方式的不利因素1昆虫物种有限2产卵数量有限3卵细胞难以渗透思考如何得到基因传播速度快，有且只有在昆虫体细胞中表达的转化载体？2.1用于非果蝇类昆虫转化的载体2.1.2用于非果蝇类昆虫转染的病毒1昆虫逆转录病毒例如：gypsy具有感染和转座双重性，一般转座效率高于转染效率2浓核病毒既可感染控制害虫，又可作为外源基因的运载工具，但感染的宿主范围比较窄3新培斯RNA病毒可高效感染蚊子成虫细胞，且支持RNA高效转录及蛋白质合成2.2用于非果蝇类昆虫转化株筛选的遗传标记颜色标记色素基因：野生型基因突变所形成的等位基因影响眼睛色素的合成眼睛颜色标记，例如地中海蝇的white基因存在的问题如果没有突变的宿主细胞怎么筛选？2.2用于非果蝇类昆虫转化株筛选的遗传标记显性筛选标记1化合物或药物抗性基因2绿色荧光蛋白（GFP）基因3改良的GFP标记系统2.3农业害虫的基因工程目标1借助共生细菌或病毒2构建具有交配优势且能使害虫子代绝育的转基因株3构建在特定条件诱导下使子代自戕的害虫转基因株2.3.1昆虫发育技术原理筛选可操作性靶基因，该基因可破坏害虫的生殖系统或使害虫子代只产生单一性别的子代，进而表现不可发育的遗传表型。典型基因1雄性特异性表达的基因2性别决定基因2.3.2条件致死型转基因株的构建1四环素抗性操纵子基因表达系统特征：目的基因的表达取决于抗生素的存在与否、转录激活因子的性质及其产生的调控机制2酵母Gal4-UAS二元基因表达系统特征：Gal4能促进UAS下游的目的基因表达，若UAS下游有适当的致死基因则可达到目的3温度敏感型致死系统特征：携带温度敏感型致死基因的个体在18摄氏度时被冻死6.2.4蚊虫的基因工程略杆状病毒昆虫细胞表达系统简介一种高产量的真核基因表达载体，因其病毒体呈杆状而得名。在昆虫细胞内，杆状病毒表达的外源基因产物可以得到各种翻译后修饰，包括磷酸化、糖基化、酰胺化、信号肽切割、蛋白质的裂解等。用该表达系统比用原核表达系统更容易获得有正确结构和修饰的活性蛋白。杆状病毒简介分为两个亚科：真杆状病毒亚科和裸杆状病毒亚科，用于外源基因表达的杆状病毒仅限于真杆状病毒亚科中的核型多角体属(NPVs)。NPV以多角体蛋白结晶基质包涵许多有囊膜的核衣壳形成多角体为特征。NPVs按囊膜内核衣壳集聚的程度分为单粒包埋型多角体病毒(SNPVs)和多粒包埋型多角体病毒(MNPVs)。杆状病毒昆虫细胞表达系统研究历史180年代初,发现多角体蛋白基因(polh)的强启动子及晚期大量表达的特性。21983年，Smith等首次建立了AcMNPV/秋黏虫细胞(spodopterafrugiperda,sf)表达系统,表达了人β干扰素.3杆状病毒昆虫细胞表达系统表达外源基因结果A感染前B感染后（普通光)C感染后（荧光）感染前和感染后72小时细胞状态比较6.3家蚕的基因表达系统6.3.1家蚕的分子生物学基础工作128条染色体，500kb的遗传连锁图谱2450Mb的全基因组316948个完全基因和7285个基因片段4鉴定功能基因5构建13个家蚕组织的cDNA文库（表6-3）6表达序列标签（EST）的序列分析6.3.2基于杆状病毒的家蚕基因表达系统杆状病毒的生物学特征1宿主只限于无脊椎动物，主要是昆虫纲的7个目2重要科属包括NPV和GV，GV颗粒比NPV小3NPV的病毒颗粒在多角体里的数目不同分为单粒包埋型病毒和多粒包埋型病毒发育循环过程参考图6-126.3.2.2杆状病毒的基因组结构四类功能基因1结构蛋白编码基因2DNA复制及基因表达调控基因3与宿主相互作用的基因4酶蛋白基因6.3.2.3杆状病毒的基因表达调控杆状病毒的表达载体系统参见图6-15质粒图谱杆状病毒表达载体的常用四种启动子1多角体蛋白编码基因启动子（polh-P)2P10蛋白编码基因启动子（p10-P)3融合或修饰启动子（p39-P-Pn)4家蚕丝心蛋白编码基因启动子杆状病毒的表达载体系统BmNPV的表达系统的优点1polh-P的强启动子介导，高效表达在强有力的多角体蛋白启动子的控制下，外源基因能高水平表达。多角体蛋白基因受控于一个启动子，这种启动子活动晚，当病毒其他多数基因和宿主基因关闭之后才开始启动，所以能大量表达外源基因，表达的产物分泌到细胞外面不致引起病毒或细胞的早日破裂，也有利于产物的分离提取。杆状病毒的表达载体系统2对脊椎动物和其他昆虫是安全的杆状病毒对脊椎动物无致病性，不在其中复制、表达或整合自身基因于细胞中。杆状病毒的表达载体系统3双链环状的病毒基因组结构易重组操作环状双链基因组容易切割、连接、重组和交换，也便于加工和改造。杆状病毒的表达载体系统4修饰加工系统接近于哺乳动物家蚕细胞体内和哺乳动物细胞的修饰系统相似，病毒基因组中多角体蛋白polyhedrin基因为非必需的，它容量大，适于插入外源基因的多拷贝，从而提高表达水平。杆状病毒的表达载体系统5重组BmNPV分子可以在蚕体和细胞培养物内表达重组病毒不仅能在细胞培养液中表达，更重要的是能在蚕体内表达，因血淋巴中含有蛋白酶抑制物，而使表达产物稳定。杆状病毒的表达载体系统病毒基因组中多角体蛋白pol