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基因工程试题及答案1.标记（探针）（已知一个克隆在质粒载体上的500bpDNA外源片段，请设计并用3种标记方法方案来对这个外源片段进行标记。带有能检测的标记物的DNA或RNA叫探针。使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程叫探针标记。1）切口平移标记:控制DNaseI的浓度，就可以在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3-OH末端（这条链即成为引物）。DNA聚合酶I把一个带有标记物的dNTP就加在这引物的3-OH末端，而它的5-3的核酸外切酶活性将切除5-单核苷酸，同时依次添加新的核苷酸到3一侧，其结果使切口沿着DNA平移，这就叫切口平移（Nicktranslation)2）随机引物标记:能与任何DNA配对互补的一小段DNA序列叫随机引物。DNA聚合酶klenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。3)PCR标记:针对目的片段，设计好引物，以标记号的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针4）末端核苷酸转移法:P32和多核苷酸激酶在5’端标记DNA或RNA。先用碱性磷酸酶处理去除DNA5’的磷酸基团，多核苷酸激酶用于对缺乏5'-磷酸的DNA或合成接头进行磷酸化,同时可对末端进行标记。补充：1）常用的标记物包括：P32的同位素标记；荧光探针标记的dNTP；生物素；地高辛2）应用：定性（是否转入该基因）；定量（含量的高低）；定位；成分（配对的程度、是否同源）2.PCR技术（试述PCR技术的基本原理，如果想通过PCR技术从一个生物基因组中扩增一个约500bp的基因片段，再和载体连接克隆，然后转入大肠杆菌中，请描述其克隆过程（包括检测）。）（1）PCR的概念：又称为聚合酶链反应,能在体外特异快速扩增DNA片段。组成：DNA单链模板、引物和DNA聚合酶（包括缓冲液）（2）PCR技术的原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。双链DNA在高温时也可以发生变性解链，随即退火使引物与模板DNA单链的互补序列配对结合，之后在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则进行子链的延伸。重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板，在很短的时间内特异性的快速扩增DNA片段。(3)克隆过程：A、设计合适的引物，大小在15-25个核苷酸之间，两个引物与模板的结合点之间要包含需扩增的片段的序列，而且引物中要含有合适的酶切位点。B、根据引物和目标片段的性质，设定各步骤反应的温度和时间进行PCR，扩增目标片段。C、用琼脂糖凝胶电泳的方法检测PCR产物，并回收目标片段。D、用相同的（或者能够得到相同末端的）限制性内切酶对PCR获得的目标片段和选择的载体进行酶切，之后将片段和切开的载体放置在同一EP管中，加入T4连接酶进行连接。E、用普通钙转或者电转的方法将连接产物转化至大肠杆菌中。F、根据载体含有的性质，选择合适的筛选标记选出转入载体的菌株。G、若基因片段无明显筛选标记，则可通过将提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测、菌落PCR或者DNA探针杂交的方法检测载体上是否含有目标片段，排除空载体的干扰。(4)PCR技术的应用A、基因组DNAPCR克隆和cDNA的RT-PCR克隆B、基因组的RAPD(随机扩增多态DNA分析，randomamplifiedpolymorphicDNA)标记分析。使用随机的短核苷酸引物，在低的退火温度下进行扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳所呈显的带型，反映着用作扩增模板的DNA分子的总体结构特征。C、临床诊断和法医鉴定。如男女性别鉴定，病毒性感染病的诊断，对单根毛发或单个精子作遗传学鉴定等。3.转基因动物的安全性问题正面观点：（1）转基因工程是不可阻挡的.基因工程将影响当代重大的环境问题:人口过剩/污染/生物多样性急剧减退等等.保护土壤/水/能源成为发展可持续农业的目标。（2)转基因食品的功效:改良植物的食用品质；增加果蔬贮藏、保鲜性能；生产特殊食品——食品疫苗。（3）迄今为止并没有发现转基因食品危害人体健康和环境的确切证据。如果转基因生物技术得不到社会支持，这一研究将被扼杀。反面观点：转基因的潜在危害：转基因动植物安全性评价主要集中在环境安全性，食品安全性以及对人动物健康的影响三方面。环境安全性分析包括：（1）生存竞争性：转基因植物在生存竞争方面具有的优势可能导致生物多样性的减少，影响了生物多样性；（2）生殖隔离距离:基因不可控制的水平转移的可能性；与近缘野生种的可交配性：外源基因是否会漂流扩散至亲缘野生种中，从而破坏自然生态平衡；（3）对非靶生物的影响：转基因植物花粉通过风，雨，鸟，昆虫，真菌，细菌以至整个生物链传播使外源基因逃逸，从而造成基因污染。（4）病毒发生异缘重组或异缘包装的可能性：自然界中存在着植物病毒之间的异缘重组。（5）对农业和生态环境的影响，生态平衡.如产生超级杂草的可能性；种植抗虫转基因作物后可能使害虫产生免疫并遗传、从而产生更加难以消灭的“超级害虫”；食品安全性：（1）转基因毒性.如英国发现转基因马铃薯会减弱老鼠免疫系统功能，美国发现转基因玉米会危害蝴蝶幼虫及其相关生态环境；（2）人的毒理反应或过敏反应.大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素，痕量的内毒素即可导致人体热原反应。（3）实质等同性的原则，即某一种生物技术产品或其成分能够与市场上现有的对应产品进行比较。如果一种转基因产品能够与现存的一种产品进行比较，并且发现具有实质同等性，便能用现产品安全性同种方法对待它。转基因植物所引入的蛋白对人体可能是异性蛋白质，在部分人中可能发生食物过敏，特别是幼儿和某些过敏体质的人。对人动物健康的影响：转入传统食品或作物中的基因可能来自各种物种，有些是人们不能或者极少食用的，是否会对人体造成危害；转基因植物食品中的新基因会不会传递给人畜的肠道微生物，插入表达，然后危害健康。动物：1.外源基因在动物基因组中的随机整合，可能会引起宿主细胞基因的插入突变、缺失突变及宿主基因的扩增重排和移位，也可能激活正常状态下处于关闭状态的基因，从而导致动物表型的改变甚至造成动物不育或死亡；2.插入的外源基因是否会影响宿主动物自身的基因表达及表达水平；3.转基因动物是否可能会把外源基因传递给生活在其周围的其它种群及环境，造成基因污染；4.在病毒等致病基因的转基因研究中，不可避免地会产生一些有害的转基因动物，是否可能因为使用转基因动物制品而将一些动物性疾病传递给人类。5.未知的.总的来说：就目前而言，还没有发现转基因食品对人类有害，但同时也缺乏证据证明它的无害性，因此产生了一些争论。.4.如何区分重组DNA和空载体自连：（一）检测方法（1）双抗性筛选：具有四环素和氨苄青霉素两种抗生素抗性基因作为选择标记，一种抗性标记用来正选择转化子，另一种通过插入失活而可以鉴定重组子。Ori位于Amp+和tet+这两个基因之间，在四环素平板上出现的菌落一定是获得了质粒的转化子，在此基础上，如果四环素抗性转化子对氨苄青霉素敏感，则说明在载体中有外源片段的插入而使氨苄青霉素抗性失活，即重组子；若对氨苄青霉素有抗性，则此转化子的质粒是空载体。（2)抗生素插入失活法：如BamHI可以从四环素位点切开，使该基因不能表达，但仍能表达氨苄抗性基因，对四环素是敏感的。筛选重组pBR322按照以下方法进行，将转化细胞培养于氨苄培养基中，只有转化细胞可以生长形成克隆，影印到四环素培养基上，不能在该培养基上生长的菌落可能就是目的克隆。（3）限制性内切酶法：外源片段通过特定的酶切位点插入到载体上，因此，可以通过这些限制性酶酶切重组质粒，电泳分析插入片段长度是否正确。（抗生素+酶切检测+测序）（4）蓝白斑筛选：多克隆位点存在于编码β-半乳糖苷酶的N端的DNA序列中，与pUC载体一起使用的宿主菌携带编码β-半乳糖苷酶的C端序列的基因片段。通过α互补机制，两个片段在体内相互弥补，产生一个有活性的β-半乳糖苷酶。以X-gal作为指示剂。若通过插入外源DNA到多克隆位点中而打断了β-半乳糖苷酶的部分基因，不能产生有活性的β-半乳糖苷酶，X-gal不会反应，重组子菌落为白色，而自连空载体转化的菌落则是蓝色的。（5）PCR法：如果已知插入DNA片段的某些序列，就可以通过PCR的方法进行鉴定（6）菌落原位杂交：把菌落或噬菌斑转移到硝酸纤维素膜上，然后溶菌，变性并固定DNA，最后用标记的DNA或RNA探针进行杂交来检测这些被转移的菌落或噬菌斑。（7）测序法：若通过前面这些方法鉴定之后还是有疑虑，不知道是否阳性者确为真阳性而不是空载体自连，可以将其送到生物公司进行测序以最终确定之。（8）基因产物检测法：如果使用的是表达载体，那么就可以通过鉴定基因产物的方法鉴定正确的克隆。（二）避免方法：（1）.碱性磷酸酶处理载体在DNA重组实验中，用碱性磷酸酶对载体DNA的5’末端除磷，可以防止载体自连，提高重组率（2）.噬菌体包装蛋白包装下限的限制：选用λ噬菌体或者柯氏载体，含有cos位点，包装35~51kb的片段，空载体片段太小，不会被包装（3）.利用某些基因(改基因存在时质粒不能在一定的菌株中存在,而此被基因为外源DNA取代时则能存在)等预防措施.5.质粒载体vs噬菌体载体：单纯以噬菌体为基础构建的载体:装载量大,能获得单链DNA,转染效率高;操作较难,DNA不稳定单纯以质粒为基础构建的载体:有天然的抗性选择标记,操作容易(宜于分离和纯化),较稳定;装载量小,转化效率较低(一)优缺点比较载体优点缺点质粒载体1.分子量非常小2.具有较高的拷贝数3.易分离4.易改造1.不稳定：分离不稳定，结构不稳定，易丢失噬菌体载体1.具有质粒性质，便于外源DNA的克隆及重组子的筛选2.有利于提高装载量3.较稳定，重组至宿主基因组4.转化效率高噬菌体可能会变化而恢复毒性对转基因动物有害等；宿主范围窄(二)异同点比较相同点：1、复制子：一段具有特殊结构的DNA序列，载体有多个复制起点才能使与它结合的外源基因在宿主细胞中独立复制繁殖。2、选择性标记：一般情况下，所要扩增的基因不便于选择，所以作为载体要求具有选择标记。易于识别和筛选，如抗药性、显色表型反应等；3、限制性酶切位点：具有一个或者几个限制性内切核酸酶的单一识别位点，便于外源基因的插入；4、载体的大小适当，可以插入一段较大的外源DNA,又不影响本身的复制；5、均有适当的拷贝数，既有利于载体的制备，还要使外源基因大量表达；6、载体的安全性：要求载体不能随便转移不同点：1、质粒载体多为双链共价闭合的环状DNA分子，而噬菌体的核酸一般为双链线性DNA分子，也有双链环形DNA、单链线性DNA、单链环形DNA及单链REN等多种形式。2、质粒多能独立于染色体之外自主复制，而噬菌体的DNA整合到寄主细胞染色体DNA上，成为一个组成部分。3、质粒常含有一些编码对细菌生存有利的基因，包含抗生素抗性基因等，而噬菌体基因一般不具有抗性基因。4、噬菌体载体的结构要比质粒复杂，噬菌体作为基因克隆载体在克隆实验时具有天然的优势，他们感染细胞比质粒转化细胞更为有效，所以噬菌体的克隆产量通常要高一些。6.如何在大肠杆菌中高效表达外源基因：涉及三个方面：（1）强化蛋白质的生物合成（重组质粒的拷贝数，转录水平和翻译速率）；（2）抑制蛋白质产物降解；（3)恢复维持蛋白质特异性空间结构。（一）．强化蛋白质的生物合成1）启动子：影响表达效率的主要因素之一是启动子的强度。高水平表达的最佳启动子必须具备的条件：（1）它必须是一种强启动子，能够使克隆基因的蛋白质产物的表达量占细胞总蛋白的10％-30％；（2）这种启动子应该是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导。2）终止子：有效的转录终止子的必要性：（1）转录产物越长，所需时间就多，外源基因本身的转录效率下降；（2）转录通读进入质粒功能区，可能干扰质粒的复制和其他生物功能，甚至导致重组质粒的不稳定性；（3）转录终止子能增强mRNA分子的稳定从而大大提高了蛋白质产物的水平；（4）转录产物过长影