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食品课程论文题目表面增强拉曼光谱技术及其生物分析应用研究进展姓名陈坤学号2009309010006专业食品科学二○○九年十二月表面增强拉曼光谱技术及其生物分析应用研究进展BioanalysisApplicationofSurface-enhancedRamanSpectroscopic（陈坤2009309010006食科院食品科学）摘要：拉曼光谱诞生距今已整整80年，激光器、CCD检测器、光纤探针技术的发展使拉曼光谱分析仪器及其应用进展日新月异。然而传统拉曼光谱信号微弱，因此表面增强拉曼散射光谱（SERS）凭借其超灵敏且具有化学选择性而被广泛应用于生物分子鉴定。它是一种信号强度高，荧光和水的背景干扰小的表面分析技术。本文就SERS在生物应用方面的研究作简单回顾。关键词：表面增强拉曼光谱（SERS）；生物分析；应用拉曼光谱是用途广泛的无损检测和分子识别技术，它能够提供化学和生物分子结构的指纹信息。但是常规拉曼散射截面分别只有红外和荧光过程的10-6和10-14。[1]这种内在低灵敏度的缺陷曾制约了拉曼光谱应用于痕量检测和表面科学领域。尽管拉曼光谱技术是一种重要的生物化学分析工具，但由于其信号强度低，而生物分子通常在自然环境下含量较低，这样得到的拉曼信号很小或者检测不到，作为信息读出手段往往缺乏高灵敏性。直到20世纪70年代中期，Fleischmann、VanDuyne和Creighton分别领导的3个研究组[2-4]分别观测和确认了表面增强拉曼现象，即在粗糙银电极表面的吡啶分子的拉曼信号比其在溶液中增强了约106倍。人们将这种由于分子等物种吸附或非常靠近具有某种纳米结构的表面，其拉曼信号强度比其体相分子显著增强的现象称作表面增强拉曼散射(Surface-enhancedRamanScattering，SERS)效应。SERS效应的发现有效地解决了拉曼光谱在表面科学和痕量分析中存在的低灵敏度问题。1.表面增强拉曼散射机理与SERS实验和应用所取得的进展相比，SERS理论的研究一直相对滞后，这主要是因为具有SERS效应的体系非常复杂。体系表面形貌和表面电子结构，光和粗糙表面的相互作用，光和分子的相互作用，分子在表面的取向、成键作用以及分子和表面的周边环境，入射光的强度、频率、偏振度和偏振方向等因素对SERS谱图的影响均比较复杂。SERS体系的这些复杂性导致了人们对SERS效应认知的多样性.人们从各个角度和具体实验条件提出了不同的SERS机理[5]。目前学术界普遍认同的SERS机理主要有物理增强机理和化学增强机理两类。SERS谱峰强度ISERS常具有以下正比关系[6,7]：式中，E（ω0）和E（ωS）分别为频率为ω0的表面局域光电场强度和频率为ωS的表面局域散射光电场强度；ρ和σ分别为分子所处位置的激发光的电场方向和拉曼散射光的电场方向；（αρσ）fi是某始态∣i〉经中间态∣r〉到终态∣f〉的极化率张量。式（1）ISERS前半部分表明，入射与散射光的局域电场强度越大，拉曼信号强度越大，这来自于物理增强机理的贡献，通常归因于电磁场增强（Electromagneticenhancement,EM）机理[8]。式，（1）后半部分表明，体系极化率（αρσ）fi越大,则相应拉曼信号的强度也越大，这是SERS化学增强（ChemicalEnhancement,CE）机理的贡献[5,9]。它是由于分子和表面之间的化学作用，从而增大了体系的极化率。1.1化学增强机理化学相互作用对反映在光电场下电子密度形变难易程度的拉曼过程是非常重要的。当分子化学吸附于基底表面时，表面、表面吸附原子（Adatom）和其它共吸附物种等都可能与分子有一定的化学作用，这些因素对分子的电子密度分布有直接的影响。化学增强主要包括以下3类机理：（1）由于吸附物和金属基底的化学成键导致非共振增强（Chemical-BondingEnhancement,CB）；（2）由于吸附分子和表面吸附原子形成表面络合物（新分子体系）而导致的共振增强（SurfaceComplexesEnhancement,SC）；（3）激发光对分子-金属（Molecule-Metal,m-M）体系的光诱导电荷转移的类共振增强（Photon-inducedCharge-TransferEnhancement,PICT）。这3种增强机理都表示体系极化率的变化对拉曼强度的影响，它们的区别在于CB增强是由于分子与表面化学吸附形成化学键，引起分子和金属间的部分电荷转移；该体系极化率的分子和分母项都没有显著变化，但是分子的HOMO和LUMO轨道展宽。SC增强是由于在表面上由部分带正电的金属原子组成的原子簇和带部分负电荷的分子以及电解质阴离子形成表面络合物，这种络合物作为新的分子体系，具有不同的HOMO和LUMO，在可见光激发下可以达到共振；该体系极化率的分子和分母项都有较大改变，特别是分母项由于满足共振条件，其实部趋于零。PICT增强并不强调表面与分子有很强的化学作用，主要取决于金属电极的费米能级和分子HOMO或LUMO的能量差；若该值与激发光能量相匹配，就会发生分子到金属或者金属到分子的电荷转移；该体系极化率的改变主要体现在中间态∣r〉上，即体系的电荷转移态。1.2SERS的电磁场增强机理在SERS效应的电磁场增强机理解释中，表面等离子体共振（Surfaceplasmaonresonance,SPR）引起的局域电磁场增强被认为是最主要的贡献[9-12]。表面等离子体是金属中的自由电子在光电场下发生集体性的振荡效应[13,14]，特定粒径的纳米粒子金属因为各自独特的等离子体共振吸收而显现出丰富多彩的颜色效应。这种等离子体的共振吸收早在19世纪人们就开始了对其内在机理进行研究。Lorenz，Mie和Debye各自独立发展了相应方法计算介质球对电磁波的散射作用，这样的理论[15-17]被称之为Lorenz-Mie-Debye理论，Lorenz-Mie理论或Mie理论。Mie首次解释了各种粒径的球形金纳米粒子的颜色起源。Gans修正的Mie理论可以处理椭球或者类椭球粒子的光学性质，较好地解释了金纳米棒的横模和纵模等离子体吸收峰，以及纵模吸收峰随粒子长径比变化的现象。由于早期Mie理论只是考虑孤立粒子的光学性质，并没有考虑临近粒子的耦合作用，而纳米粒子之间的耦合作用对其自身的光学性质和SERS的增强作用都有很大的影响。当粒子之间的距离小于粒子本身的尺度，甚至在发生团聚时，等离子体共振峰（SPR）发生红移，同时在更长波长的位置出现吸收峰，这些谱峰被认为是类似于纳米棒中的纵模共振峰。为了克服Mie理论的缺陷。人们发展了有效介质理论，特别是Maxwell-Garnett理论，很好地解释了多粒子耦合的光学现象。除此之外还发展了存在解析解的广义Mie理论，数值求解的时域有限差分方法（FiniteDifferenceTime-Domain，FDTD）。例如，通过拟合金属的介电常数，利用三维时域有限差分（3D-FDTD）方法模拟了不同形状的纯金属纳米粒子的电场分布，模拟了核壳结构的异质材料的光电场分布等。模拟结果表明可以利用SERS的电磁场增强的长程效应，采用“借力”的策略，以高SERS活性的Au，Ag和Cu纳米粒子为基底或核，分别在其表面沉积或者修饰上极薄层的非SERS活性或者弱SERS活性材料，从而获得在这些材料上吸附的分子的高质量SERS谱，以拓展SERS研究和应用体系。此外，离散偶极近似方法（DiscreteDipoleApproximation）也常用来数值求解特殊形状的纳米粒子的光学性质。定量模拟电磁场增强的分布，并与纳米粒子的表征技术相结合，可以指导人们合成具备某种光学性质可控的纳米结构材料，并推动SERS成为广泛应用于化学传感和生物医学检测方面的有力工具。2.新型SERS活性基底20世纪80年代SERS的发展遇到了不少难题：①仅有金、银、铜3种金属和少数极不常用的碱金属（如锂、钠等）具有强的SERS效应；②金、银、铜金属尚需表面粗糙化处理之后才具有高SERS活性，故常用的平滑单晶表面皆无法用SERS研究；③实验上所观察到的很多复杂现象尚无法用现有的SERS理论进行解释。20世纪90年代以Kneipp和NieS为代表的一些小组对上述问题进行了理论与实验研究，取得了突破性的进展：SERS增强因子从最初的104～106提高到了1014～1016，SERS逐渐发展成为单分子科学研究手段之一[18,19]；在系列纯过渡金属元素（第Ⅷ副族元素）以及其它体系中观察到SERS效应[20,21]。目前吸附分子产生表面增强拉曼散射的金属有Ag、Au、Cu、Li、Na、K、In、Al、Pt、Rh、Ni、Ti、Hg、Cd、Pd等，化合物有TiO2、NiO等[22]。纳米技术的发展给SERS技术的发展注入了活力，例如，某些纳米粒子体系的SERS信号可以放大至百万亿倍，因此有望成为单分子科学中的重要检测工具。[19,23]近年来，SERS被广泛地应用于表面吸附[24]、电化学和催化反应[24,25]、化学和生物传感器[23,26]、生物医学检测[27-29]及痕量检测与分析[30]等领域。在发现SERS效应之后，人们发现表面增强效应也普遍存在于其它光谱学中，通过对各种表面增强光谱的系统研究发现，它们都具有强烈依赖于特定的金属纳米结构的共性。为了达到增强效果，应选择直径10-100nm接近待分析分子的金属粒子。增强途径很多，常用技术及使用的纳米粒子均列于表1中。金银溶胶，薄层和电极是最常用的增强基底。Table1CommontechniquesusedtomakeSERSactivesubstrates.MethodDescriptionElectrochemicalMetallicfoilsgothroughoxidationandreductioncyclestoroughenthesurfaceChemicalreductionMetalcolloidsareproducebythereductionofsilverorgoldwithvariouschemicalsEvaporationMetalvapoursaredepositedonvarioussupportsundervacuumconditionsChemicaletchingAcidsareusedtoerodethesurfaceofmetalfoilsMetalliccoatingSilver/silvercolloidalsolutionsaredriedorevaporatedontodifferentsubstratebases金纳米粒子易控制大小分布，稳定性好，与抗体、抗原蛋白质，DNA及RNA有良好的生物相容性，它已经成功的应用于标记技术，合适大小和粗糙度的金溶胶粒子很适合做SERS基底。因此，标记免疫纳米粒子通过各种生物反应识别待测部分，可以很好的达到检测要求。3.生物分析应用拉曼光谱具有灵敏度高、需样量浓度低（10-3~10-5mol·L-1）、反映信息量大以及不受水溶剂的干扰等优点，此外还可以针对复杂分子的不同生色团进行选择性共振激发（生物分子在250~750nm范围内有较强的吸收谱带），因此激光拉曼光谱被广泛用于研究DNA、胆色素、卟啉等生物分子的结构表征及其与药物分子的相互作用[31-33]。采用表面增强拉曼光谱手段对几种季铵盐化合物与DNA之间的相互作用，结果表面拉曼光谱作为一种抗癌药物筛选和药物作用研究手段具有十分广阔的应用前景[33]。3.1生物分子检测3.1.1氨基酸溶液SERS实时SERS观测在生物分子研究领域有着卓越的应用前景，如核酸和氨基酸识别。这项工作致力于对氨基酸的光诊断应用研究。氨基酸是构成蛋白质和酶的基础物质。要组成不同的蛋白质需要多种氨基酸来组合。一个氨基酸通常大于100nm，所以这个氨基酸只有部分能连到Ag+基底上[34，35]。据此来推测Glu和Asp在中枢神经系统损伤中的作用[36]。3.1.2肽链SERS肽链大多是通过