搜索
★年级、专业、班级：2010级临床三、四大班★实验课时间：2012年4月18日★实验室：第二实验室★组别：第四组★组员：梁婧、和珍、李艳、张玲艺、解汐卓、成春梅、吴皎、杨紫燕、王骁、张庆昆★报告人：吴皎患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5µmol/L，结合胆红素13.7µmol/L，未结合胆红素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。1、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？2、请设计实验进一步明确诊断。3、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。4、要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？5、患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？初步判断患儿是何种疾病？红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症（蚕豆病）性别：男性年龄：3岁主要症状：体温38℃、面色苍白、血尿1天、皮肤及巩膜黄染、恶心、呕吐诱因：1天前食用新鲜蚕豆既往史：患者的姐姐也曾发生过类似情况·概念：G6PD缺乏症是一种遗传性溶血性疾病。发病率具有地方、民族差异性。发病机制：G6PD↓→NADPH+H+↓→GSH↓→红细胞的抗氧化能力↓→发生溶血红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症正常红细胞溶血性贫血红细胞左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿（黄疸）左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿（黄疸）正常红细胞溶血性贫血红细胞左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿（黄疸）正常红细胞溶血性贫血红细胞左：健康新生儿右：溶血性贫血患儿（黄疸）·分类：伯氨喹啉型药物性溶血性贫血新生儿黄疸蚕豆病感染性溶血先天性非球形细胞溶血性贫血（CNSHA）红细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。主要临床表现：早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿，尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重，可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时，出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功能异常，约50%患者脾肿大。严重病例可见昏迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于1～2日内死亡。遗传方式：G6PD缺乏症是一种X连锁不完全显性遗传母：XX父：XY子代：XXXXXYXY儿子一定患病，女儿则50%母：XX父：XY子代：XXXXXYXY儿子一定正常，女儿则50%母：XX父：XY子代：XXXXXYXY女儿50%机会患病，儿子50%机会携带该基因X---致病基因患该病的男女比例约为=7:1从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果主要临床表现：1.血尿、排酱油色尿、面色苍白2.皮肤及巩膜黄染3.体温升高4.呼吸急促1.血尿、排酱油色尿、面色苍白G6PD↓GSSG(氧化型谷胱甘肽)NADPH+H+NADP+AAH22GSH(还原型谷胱甘肽)GSH的主要作用：①保护红细胞内的含硫氢基（-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜蛋白的完整性，免遭氧化②与谷胱甘肽过氧化酶共同使H2O2还原成H2O→NADPH+H+↓→红细胞的抗氧化能力↓→GSH↓→红细胞膜破裂→溶血性贫血（面色苍白）→游离Hb肾吸收阈值→血红蛋白尿/含铁血黄素尿2.皮肤及巩膜黄染机理：溶血性黄疸3.体温升高机理：红细胞破裂↓血红蛋白暴露↓免疫系统攻击（单核-吞噬细胞系统）↓体温升高4.呼吸急促溶血性贫血↓具有载O2能力的Hb含量下降↓机体缺O2↓呼吸急促红细胞1.98×1012/L↓↓（6.0-7.0）×1012血红蛋白53g/L↓↓（170-200)g/L血清总胆红素85.5µmol/L↑↑（3.4-17.1）µmol/L结合胆红素13.7µmol/L—未结合胆红素71.8µmol/L↑↑尿蛋白（++）、潜血(+)尿胆红素(－)、尿胆素原(+)从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果实验室检查结果正常值2、设计实验进一步明确诊断。贫血、黄疸有和无遗传史无或有诱因（食用蚕豆、服用药物、感染）体征：脾肿大、黄疸血常规检查血清学检查检查HA的病因G6PD筛选试验G6PD确诊试验Hb↓、网织红细胞↑间接胆红素↑尿胆原↑游离Hb↑结合珠蛋白↓怀疑其他HA,相应病因检测结果正常G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定G6PD基因分析其他筛选试验高铁血红蛋白还原试验初诊或确诊G6PD缺陷症确诊溶贫（血管内溶血）确诊G6PD做1项或2项做1项高铁血红蛋白还原试验G6PD荧光斑点试验红细胞G6PD活性测定筛选试验→确诊试验一、高铁血红蛋白还原试验实验原理：在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）。亚铁血红蛋白高铁血红蛋白亚硝酸钠高铁血红蛋白还原酶NADPH(辅酶)亚甲蓝(递氢体)实验反应方向实验原理主要试剂：0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液①、0.4mmol/L亚甲蓝溶液②、0.28mol/L葡萄糖溶液③、混合液（等量①+②+③）、生理盐水、抗凝剂仪器：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支高铁血红单白还原实验实验流程取静脉血1.8mL于抗凝管，混匀抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝剂+葡萄糖20mg)离心沉淀1000r/min15min调整血细胞∶血浆=1∶1，混匀→调整后全血（备用）1ml0.18mol/L亚硝酸钠1ml0.28mol/L葡萄糖溶液混匀→混合试剂（备用）1ml0.14mmol/L亚甲基蓝液高铁血红单白还原实验实验流程取试管3支,标上A、B、S,按下表加入试剂高铁血红蛋白还原试验操作步骤混合试剂/mL0.01//生理盐水/mL/0.01/0.18mol/L亚硝酸钠-//0.010.28mol/L葡萄糖溶液/mL经调整的全血/mL0.10.10.1来回摇动15～20次,置37℃水浴箱静置3h蒸馏水10.00ml10.00ml10.00ml试剂ABS高铁血红单白还原实验B管为空白管,在波长635nm处，测定“A”管及“S”管吸光度实验流程计算高铁血红蛋白还原率公式：MHb%=(1-A/S)×100%高铁血红单白还原实验实验过程注意事项实验一（高铁血红蛋白还原试验）：1、血细胞比容比值过低，高铁血红蛋白还原率降低。应将血细胞比容调整到0.35-0.402、细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等应无菌3、不稳定Hb、高脂血症等均可出现假阳性结果，故应2h内送检4、标本不应有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在标本内应适当加入葡萄糖，以避免较全血缺乏二、G6PD荧光斑点试验实验原理：葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在340nm波长紫外线照射下产生荧光（反应原理如下图）。所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性NADPNADPHG6P6PGAG6PD实验原理试剂：反应液：G-6-P液1份、NADP液1份、皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3份混匀仪器：长波紫外灯、滤纸、水浴箱G6PD荧光斑点试验实验流程G6PD荧光斑点试验取试管，加10μl全血+100μl反应液，混匀，取一滴于滤纸上（第一斑点）→作为对照将上液置于37℃水浴10min，再取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）→实验组晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果，计时根据结果作出相应诊断实验二（G6PD荧光斑点试验）：1、检测的第一点作为实验对照应无荧光或弱荧光出现2、每次试验应用正常标本（已知G-6-PD正常）作阴性对照。如可能选用已知G-6-PD缺乏者的标本作阳性对照3、如贫血严重取血量应相应加大，或用红细胞混悬液进行检验4、为提高敏感性可在反应液中加入1份8.0mmol/LGSSG实验过程注意事项三、红细胞G6PD活性测定实验原理：基本原理同G6PD荧光斑点实验。不同的是利用紫外光分光光度法定量测定酶活性，即每隔一分钟在340nm波长测定孵育液中NADPH吸光度（测6次），求每分钟吸光度增加的平均值，根据单位时间内NADPH生成由于所用试剂及体系的不同。方法：①WHO推荐的Zinkham;②NBT定量法等实验原理试剂：生理盐水、溶血素、3.8mmol/LNADP、0.5mol/LTris缓冲液（pH7.5）、0.63mol/L氯化镁溶液、33mmol/LG-6-P液仪器：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管实验流程取抗凝血2ml，生理盐水洗涤红细胞3次（1500r/min离心10min）除去上清液和乳白层（白细胞和血小板）加等体积生理盐水→红细胞悬液红细胞悬液0.05ml+溶血素0.5ml，混合，放置10min→溶血液并测定其Hb浓度进行比色（见下表）红细胞G6PD活性测定G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法)试管对照管测定管NADP液（ml）0.10.1Tris液（ml）0.10.1氯化镁液（ml）0.10.1蒸馏水（ml）0.680.58G6P液（ml）—0.137℃预热溶血液（μl）2020红细胞G6PD活性测定立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37℃恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的变化实验流程计算公式：G-6-PD活性（U/gHb）=△A/min×1000/6.22×1020/20×Hb(gL-1)△A/min:每min吸光度的平均变化值1000/6.22:为微摩尔消光系数1020/20:总容量与溶血液的量之比；实验流程红细胞G6PD活性测定实验三（红细胞G6PD活性测定）：1、急性溶血期后2~3个月再查或复查G6PD活性2、最好同时作阴性对照和阳性对照（影响因素多）3、离心沉底后应取底层红细胞测定G6PD活性实验过程注意事项结果分析方法一、高铁血红蛋白还原试验：正常值：MHb还原率=75%，脐血=77%临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者：MHb还原率30%脐血40%杂合子患者：MHb还原率31%~74%脐血41%~76%二、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光斑点试验正常人：0min斑点无荧光，5-10min出现，10min荧光最强临床诊断：轻度缺陷者：0-10min荧光很弱或不出现中度缺陷者：10-30min出现荧光严重缺陷者：30min内不出现荧光结果分析方法三、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性测定G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以上即可作出诊断方法正常值范围WHO推荐的Zinkham(12.01±2.09)IU/gHb(37℃)ICSH推荐的Glock与McLoan法（8.34±1.59）IU/gHb(37℃)NBT定量法（13.1~30.0）NBT单位Chapman和Dern法（2.8~7.31）IU/gHb(25℃)结果分析方法G6PD缺乏症的诊断要点临床符合上述任何一型，加上以下各项中任何一项均可诊断①1项筛选试验活性严重缺乏值②1项筛选试验活性属中间缺乏值，伴有明确的家族史③2项筛选试验活性均属中间缺乏值④1项G6PD活性定量测定其活性较平均值降低40%以上综合诊断诊断要点可以用哪些技术检测什么目的基因？——G6PD基因分析·探针技术放射性核素生物