蛋白质复性37页PPT

第十章蛋白质复性refolding提纲1.变性与复性2.包涵体的形成和性质3.包涵体的纯化和溶解4.蛋白质的复性5.蛋白质体外复性的常用方法1.变性unfolding与复性refolding变性过程总伴随着蛋白质的物理、化学、生物学性质的变化，如溶解度改变、体积变大、黏度增加、扩散系数降低、生物活性降低或消失等。蛋白质变性时肽链伸展而失去特定的空间结构，这一过程称为肽链的伸展或去折叠。随着这一过程的进行，整个分子也由天然蛋白质紧密的、球状或近球状结构伸展为松散的无一定空间结构的链状分子。许多变性蛋白质在去除变性因素后，可自发地恢复它原来的空间结构和生物活性，这称为变性蛋白质的再折叠或复性。（p384）复性有关理论蛋白质从去折叠状态向折叠状态即天然状态转变的过程中，必须经历一个高自由能的过渡态。蛋白质复性过程中能量变化示意图复性有关理论在这个过渡态中蛋白质可有多种构象形式，而天然状态蛋白质可能有一种或有限的几种构象状态存在。蛋白质的再折叠是依据最小能量原则进行的，假设蛋白质的天然构象是能量最小的构象，变性态蛋白质分子会自发的向这个最小能量状态转变。这就是“热力学假说”。该理论认为：蛋白质天然构象形成具有协同性，其能量差别足以区别天然构象和其它构象。大部分蛋白质的天然构象应是能量最小构象。复性有关理论大量研究还发现，许多蛋白质在体外的变性复性过程并非完全可逆，且体外复性速度远比体内低，多肽链折叠过程中受到许多因素的限制，如S-S键重排和脯氨酰顺反异构等都是折叠反应的限速步骤，实际多肽链在折叠过程受到动力学控制。蛋白质在折叠过程中会有两种途径相互竞争，一种是正确折叠形成天然构象的途径，另一种是错误折叠成稳定的非天然构象的途径。蛋白质多肽链的正确折叠是一些因素在折叠动力学过程中起到控制作用。复性有关理论“动力学假说”与“热力学假说”并不互相否定，而是互相补充与修正，对不同蛋白质而言，二者在蛋白质多肽链折叠过程中所起的作用大小不同，各有特点。总体上，蛋白质的折叠遵循“热力学假说”，从高能态向低能态转变的过程又受动力学控制。一些小分子单结构域蛋白质的折叠过程相对简单些；热力学控制下能容易地进行可逆的变性、复性；结构比较复杂的蛋白质，特别是涉及S-S键重排，脯氨酰顺反异构限速步骤的折叠反应，总体上受热力学控制，但折叠途径即动力学控制比较重要。复性有关理论两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构的蛋白质分子。按拓扑学观点认为：虽然蛋白质内部基团相互作用复杂，使得不同蛋白质的折叠复性过程不相同，但不同蛋白质多肽链穿越空间的形式可能会是相同或类似。实验中也发现，蛋白质拓扑结构的氨基酸序列不改变对蛋白质的折叠速度等参数影响很很少。因此，该理论认为，蛋白质的折叠过程的许多参数及其折叠机理可能与蛋白质的拓扑结构有密切关系。2.包含体的形成和性质•在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。包涵体形成的几种可能性研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞内溶解度时沉淀；2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对；3）蛋白产生量过多，所需其他成分(如折叠酶和一系列翻译后修饰酶及分子伴侣等)不足；4）重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多、Pro含量越高越容易形成包涵体。5）重组蛋白所处的环境：发酵温度高时容易形成包涵体。6）丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体。减少包涵体形成的策略1）降低重组菌的生长温度：较低的生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包涵体的形成。2）添加可促进重组蛋白质可溶性表达的添加剂，如：培养E.coli时添加乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态，从而影响二硫键的形成）等。3）供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH等。4）将目标蛋白与亲水蛋白、分子伴侣、折叠酶等共表达；包涵体形成：Advantages1、细菌的生长快速利于大规模生产。包涵体形式表达的蛋白质浓度比较高，有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的40%2、重组蛋白质以包涵体形式存在→包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击3、分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离4、有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵体形式的蛋白质因丧失了生物活性→高效地表达3.包涵体的纯化和溶解路线二A4、成品加工精制(结晶、干燥)3、高度纯化(层析、电泳)脱盐浓缩2、初步纯化(盐析、萃取、超滤等)路线二B包涵体溶解(盐酸胍、脲)复性发酵液预处理细胞分离路线一清液－胞外产物路线二细胞－胞内产物细胞破碎碎片分离发酵液的预处理与固液分离不溶物的去除包涵体加工流程离心去除细胞碎片（膜蛋白和脂类等）机械破碎法包涵体提取如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产业化的一个难题包涵体的洗涤•为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀•常用去污剂TritonX-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如2mol/L尿素或盐酸胍等，注意：过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解）洗涤以除去脂类和膜蛋白。•如：50mMTris-HCl，pH7.0-8.5，2M尿素，1mMEDTA包涵体的溶解•大多数在pH8的条件下，用强变性剂如8mol/L尿素、6mol/L盐酸胍，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展•对于含有S-S的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。为将包涵体充分溶解，需加入还原剂（如二硫苏糖醇DTT、GSH、β－巯基乙醇β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，一般是50-100mMβ-ME或DTT（对于目标蛋白没有二硫键的有时也应使用还原剂，因为含S-S的杂蛋白会影响包涵体的溶解）•加入金属螯合剂，如EDTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等金属离子，防止已经处于还原状态的SH-与之发生氧化反应。•包涵体溶解后，蛋白质成为失去了生物学活性伸展肽链4.蛋白质复性•蛋白质复性过程中，涉及两种疏水相互作用：•一是分子内的疏水相互作用•→促使蛋白质正确折叠•二是肽链分子间的疏水相互作用→导致蛋白质分子间聚集，形成寡聚体和多聚体→再进一步聚集形成沉淀→两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。→复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提高复性收率的关键。伸展态U中间体I局部肽段先由氢键形成一些二级结构构象单元，如α螺旋、β折叠、β转角等聚集体A天然态N快慢影响复性效率的因素1）蛋白质本身的性质有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11；一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率在20%左右2）蛋白质的复性浓度I向N的转化是一级反应，而聚沉是二级或多级反应聚沉的反应速度与蛋白质浓度的平方或高次方成正比而复性反应过程与蛋白质浓度的一次方成正比，故浓度越大，聚沉反应越明显。→复性时蛋白质浓度宜低（低浓度时，获得的蛋白质复性效率比高浓度要好的多）浓度过低又给后处理带来不便，一般选择10－100μg／ml，以避免分子间相互作用力引起聚集。•3）变性剂浓度和复性时间•在高浓度变性剂存在时，蛋白质主要以U存在（6mol/L盐酸胍、8mol/LUrea等）；在中间浓度时（较低浓度的盐酸胍和Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白质分子间的疏水相互作用，又不会妨碍蛋白质分子内疏水相互作用的形成。•由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长的一段时间，I就可以慢慢地向N转化•4）氧化还原环境•复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形成S-S的环境→合适的氧化还原环境•采用配对的氧化型和还原型巯基物质•配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基乙醇/胱氨酸等。通常还原型巯基物质的使用浓度为l~3mmol/L，还原型/氧化型的摩尔比为10：1或5：1。5）pH和温度最适宜的复性pH值应大于7.0（一般8.0-9.0），以防止自由SH-的质子化作用影响正确配对的S-S的形成。应避免在蛋白质pI处进行复性（蛋白质的静电排斥力几乎为零，相互间疏水作用区域就容易作用而形成A）。温度过高，蛋白质的聚集将十分严重，低温下聚集和折叠反应都很慢，随着温度的上升二者的速度都加快→常在室温下进行6）折叠促进剂能够促进蛋白再折叠的化学物质统称为折叠促进剂，折叠促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、抑制肽链间的疏水相互作用。应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活性剂、聚乙二醇PFG、L－精氨酸、抗体、分子伴侣等。例：人-干扰素的后处理工艺发酵液离心(发酵液冷却至10C以下，4000r/min离心10min)菌体细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积PBSbuffer,冰浴超声破碎5次,30s/次,4000r/min离心30min)，洗涤(0.1%TritonX-100溶液，1000r/min离心20min，重复三次)包涵体提取变性(包涵体+8M尿素pH8.050mMTris-HClbuffer0.2mMEDTA,10mMDTT室温搅拌2h,离心(15000r/min,30min)例：人-干扰素的后处理工艺变性蛋白液稀释(取1份变性液+99份上述buffer(不含DTT与尿素)，使尿素终浓度小于0.1M，4C下搅拌24h）复性液浓缩(用截留10kDa的超滤器浓缩100倍)，透析后离心(15000r/min离心30min)浓缩上清液Sephacryls-200柱层析分离：层析柱2100cm，pH8.050mMTris-HClbuffer平衡洗脱5.蛋白质体外复性的常用方法稀释\透析\超滤复性法折叠促进剂协助复性法：表面活性剂、PEG、分子伴侣等反相胶团复性法、双水相体系复性法层析折叠复性（固相复性）：凝胶过滤层析（GF）、亲和层析（AFC）、离子交换层析（IEC）、疏水层析（HIC）等蛋白质复性时聚集反应的抑制复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反应。最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原理为：•稳定正确折叠蛋白质的天然结构，•降低错误折叠蛋白质的稳定性，•增加折叠复性中间体的溶解度，•增加非折叠蛋白质的溶解度，•减少复性中间体接触发生聚集反应。聚集反应抑制剂的种类：1.可促进蛋白质折叠的小分子添加剂，如盐酸胍或尿素，以及一些离液化合物，如烷基尿素、碳酸酰胺类化合物等。在非变性浓度下，是很有效的促进剂。2.对于某些需要辅因子才表现活性的蛋白质，辅因子、配基、或底物具有很好促进折叠的作用。Zn2+和Cu2+可稳定折叠中间体。浓度为0.5~1.0mol/L的L-精氨酸可大幅度提高折叠效率（使不正确折叠和二硫键不稳定）。3.PEG促进折叠复性，PEG与复性中间体特异形成非聚集的复合物，阻止复性时疏水中间体的聚集，复合物折叠形成第二个中间体，并不再与PEG结合。天然蛋白质即由第二个中间体形成。在有PEG存在下的所有的折叠反应具有相同的速率，复性率与PEG的分子量及浓度相关。认为PEG的作用与分子伴侣的作用机理相似。4.非离子型表面活性剂，尤其是离子型或两性离子表面活性剂。如Chaps、TritonX-100、磷脂、十二烷基麦芽糖苷、磺酸甜菜碱等对蛋白质