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TECONTECHNOLOGYCENTERNOVALIU昆虫细胞系的生长和维持细胞系简介：本手册包括Sf9、Sf21和H5昆虫细胞以及提供相关昆虫细胞生长和维持的一般信息。Sf9、Sf21和H5细胞系适于用杆状病毒或其他昆虫表达系统表达重组蛋白。运输与储存：运输：置于干冰上。储存和传代：置于液氮储存。收到细胞即可开始，详见14页。细胞系比较：下面的表格总结了Invitrogen细胞系一般特征。订购信息见下页。细胞倍增时间细胞外观初始培养基Sf972h规则的带有颗粒球形。贴壁紧。TNM-FHSf2124h不同大小带有颗粒球形。贴壁紧。TNM-FHH518h不同大小带有颗粒球形。贴壁松。ExpressFiveSFM重要事项：Invitrogen（生命技术部分）通过RT-PCR证实H5细胞藏匿有内生的野田病毒。在一定条件下，H5产生野田病毒粒子。如此产生的病毒粒子未表现出对内原蛋白表达的不利的影响，或着在限制使用证书66号下已延伸和提供对H5细胞其它研究应用（见35页）。更多信息请联系技术支持。用途：仅供研究使用。禁止用于动物或人的疾病治疗和诊断。Sf9和Sf21细胞系：来源：Sf9（货号B825-01）和Sf21（货号B821-01）细胞系是传统的用于杆状病毒表达的细胞系，源于美国农业部昆虫病理实验室。此细胞系适用于InsectSelect系统。这两株细胞衍生于IPLBSF-21细胞系，来源于秋蝇蠕虫（草地夜蛾）蛹的卵巢组织。特征：Sf9和Sf21有下列共同特征：易于形成单层和悬浮培养、适用无血清培养基。大小不同：Sf9细胞系克隆分离于IPLBSF21-AE(Sf21)。体积较小大小规则的使其易于形成单层和铺培养板。Sf21在大小和形成单层以及铺板规则上有一些不同。用途：两者都适于转染、纯化、生产高滴度病毒、铺板以及表达重组蛋白。如果你是第一次使用杆状病毒，你会发现Sf9细胞易于从斑块中分离。在一些结构上Sf21细胞可能比Sf9细胞表达蛋白量高。H5细胞系：来源：H5细胞系源于博伊斯汤普森研究所对植物的研究，伊萨卡、纽约和源于白菜尺蠖卵巢细胞，粉纹夜蛾。特性：此细胞系有如下特性:-1-TECONTECHNOLOGYCENTERNOVALIU●倍增时间小于24h；●适于贴壁培养，但易形成不整齐的单层，导致空斑鉴别困难；●适于悬浮培养和无血清培养；●提供5-10个折叠（针对选择的蛋白）分泌表达量比Sf9细胞高。用途：H5细胞表达重组病毒性能优越。也经常用于转染和空斑纯化；然而，如果重组体不是蓝色分离重组的空斑就比较困难。昆虫表达系统：大量从Invitrogen获得的表达系统在Sf9、Sf21或H5昆虫细胞中能便利的表达重组蛋白。Bac-to-Bac杆状病毒表达系统适于用杆状病毒来表达重组蛋白，同时InsectSelect适于用无细胞溶解素的系统来表达蛋白。更多关于表达系统的信息请访问或致电技术服务。哪个细胞系昀好用?推荐Sf9或Sf21细胞用于转染、纯化和增殖重组病毒。Sf9细胞大小一致，易于操作，能形成良好的单层细胞用于空斑实验。Sf9和Sf21细胞也能用于重组蛋白的表达，但是H5细胞系的生产量更高。推荐用H5细胞系来表达分泌型重组蛋白。其能在无血清培养基中培养，适应悬浮培养以及能生产大量的重组蛋白。注意：一般来说易于用一种细胞系来表达蛋白达到昀优化的程序。一旦确定用一种细胞来表达重组蛋白，其它细胞系可以尝试优化表达水平。注意:当设计纯化多聚组氨酸标签蛋白的计划时，注意无血清培养基不能直接用于螯合树脂，因为培养基的成分会除去树脂中的镍离子。订购信息：见下表从Invitrogen获得冻存细胞信息细胞冻存Sf9货号：B825-011×107细胞/ml60％Grace's培养基，30％胎牛血清，10％DMSOSf21货号：B821-011×107细胞/ml60％Grace's培养基，30％胎牛血清，10％DMSOH5货号：B855-023×106细胞/ml添加90mL/L谷氨酰胺的ExpressFive®SFM需要92.5％7.5％DMSO培养基昆虫细胞培养基：Sf9，Sf21和H5能在含血清或无血清培养基中生长（更多信息见12页培养基注意事项）。推荐如下培养基用于每个细胞系（见下表）。-2-TECONTECHNOLOGYCENTERNOVALIU细胞含血清培养基无血清培养基Sf9Grace's昆虫培养基Sf-900ⅡSFMSf21Grace's昆虫培养基Sf-900ⅡSFMH5Grace's昆虫培养基ExpressFive®SFM培养基订购信息：从Invitrogen获得的GIBCO®昆虫培养基用于培养Sf9，Sf21和H5昆虫细胞。订购信息见下表。产品数量货号非悬浮Grace's昆虫培养基500mL11595-030悬浮Grace's昆虫培养基500mL11605-094500mL10902-096Sf-900ⅡSFM1L10902-088ExpressFive®SFM1L10486-025方法细胞操作技术无菌技术：需在层流罩无菌条件下进行昆虫细胞培养。传代培养：传代培养需将细胞调整到维持对数生长状态和昀大活率。贴壁培养:贴壁细胞传代需在细胞长成单层（如下定义）然后1：5（细胞体积：昀后培养基体积）稀释维持对数生长。例如：T75方瓶装12mL培养基长成单层。将细胞吹下来，取2mL移入新的装有8mL培养基的T75方瓶，这就是1:5稀释（昀终10mL体积中含2mL细胞）。悬浮培养：在细胞密度达到2.0×106-2.5×106细胞/mL后将密度调整至0.7×106-1.0×106细胞/mL进行悬浮传代。例如：在装有50mL细胞培养基的100mL摇瓶中细胞密度达到2.0×106细胞/mL。移取25mL含细胞的培养基再加入25mL新完全培养基使细胞终浓度达到1.0×106细胞/mL。融合：融合是细胞进行传代培养的标志。定义：贴壁细胞汇集成单层布满整个获得的生长表面。在形成第一层或开始从壁面悬起后，一旦细胞形成团簇，就要开始进行传代。传代融合细胞：细胞在旧的融合表现倍增时间较少或活率降低以及减少贴壁时应立即传代。细胞培养以及认为不太健康了。融合前传代：未形成融合前的细胞不易移除，需较大的机械力。在未融合前传代，细胞表现倍增时间较短或活率降低（更多信息参见30页疑难解答）。细胞培养以及认为不太健康了。漂浮物：-3-TECONTECHNOLOGYCENTERNOVALIU漂浮物常发生且常见于旧培养基和过度生长培养基中。定义：细胞无论是松散贴壁或悬浮于培养基中。注意：如果漂浮物超过5％，在传代之前用新鲜的培养基取代含漂浮物的培养基。存活的漂浮物：许多漂浮物仍然存活。检查活率，移取一小份含漂浮物的培养基用于台盼蓝染色实验。假如漂浮物的活率较高（〉95％），细胞可用于增殖，将含漂浮物的培养基移至装有新鲜培养基大小合适的瓶子中。脱落：非常柔和的培养方法可使细胞活率高。特别用这种方法移除贴壁培养的细胞。定义：通过培养基吹打从壁面移除细胞。此技术程序见贴壁培养17页。倍增时间：昆虫数量倍增时间不同，依赖于生长条件。健康细胞倍增时间：●Sf9细胞倍增时间72h；●Sf21细胞倍增时间24h；●H5细胞倍增时间18-24h。注意：如果倍增时间超过24-72h，则初始细胞浓度、活率、培养基、温度或氧化作用可能出现问题。更多有关倍增时间超过24h的信息见30页疑难解答。活率：为了维持昀佳贴壁和悬浮状态，应通过细胞计数有规律的进行评价细胞活率。定义：细胞活率是指在培养基中活细胞所占的比例。细胞活率是通过台盼蓝染色测定。台盼蓝染料不能通过活细胞膜，但能很快进入死细胞。变蓝的细胞就是死细胞。昀低要求：健康对数生长期细胞活率至少应不低于90％。活率低于90％细胞不是在昀佳条件下培养不能用于实验。如果你的细胞有活率低于90％的问题见第30页疑难解答。细胞记录：细胞记录对于监控昆虫细胞密度和活率非常重要。做好细胞记录能使你记住需要进行细胞培养的日期。并且细胞记录有助于疑难问题的解决（见第30页）。定义：细胞记录或细胞笔记应包括如下内容：●昀初培养日期；●原始发货批号；●传代日期；●每次传代的代次；●传代的密度；●传代的活率；●冻存代次；●任何细胞出现的情况；●培养基及其批号。生长温度：干燥的环境中维持细胞生长需27℃。新鲜培养基在使用前需升至室温。室温细胞维-4-TECONTECHNOLOGYCENTERNOVALIU持生长置于工作台上或抽屉里，但建议环境温度控制在27℃。低于27℃：低于27℃昆虫细胞生长缓慢。当温度恢复到27℃，细胞能恢复到正常倍增时间。高于27℃：27℃-30℃之间，昆虫细胞倍增时间加长。高于30℃细胞活率降低。细胞长时间暴露在30℃以上高温则不能再用。如果温度恢复到27℃细胞也不能恢复原来的状态。CO2：昆虫细胞培养不需要CO2。浓缩细胞：如果细胞密度太低（＜5×105细胞/mL）细胞需浓缩以达到对数生长。浓缩细胞至较高密度（1×106细胞/mL）将出现对数生长状态（见第27页）。细胞分散：在转染和空斑试验之前，细胞需均刀的分散至组织培养板表面。目的：这将确保如下：a)细胞分散不均，导致形成不刀称的单层；b)昀大表面积用来感染。步骤：分散细胞，用手从前往后一边到另一边慢慢轻摇细胞瓶或板子。重复四次，仔细观察确保液体布满所有生长表面。不要用圆周运动来分散细胞，这样会引起细胞聚集板子边缘而不均刀分布。重要事项：所有添加或移除培养基操作需在层流罩下进行，且在无菌条件下及使用无菌设备。添加或移除培养基-方瓶：从方瓶中移除含细胞的培养基时，倾斜瓶子使培养基流到瓶角，远离细胞单层。用移液管小心移除培养基。避免触碰细胞单层。添加培养基时，轻柔的吸取培养基置于远离细胞单层的一边。在细胞贴壁松散和部分脱落时轻柔的处理细胞。添加或移除培养基-培养板：从摇瓶中移除培养基，拧掉摇瓶臂上的螺丝帽。小心从瓶臂插入移液管不触及瓶壁吸除培养基。从摇瓶的瓶臂小心移出移液管，避免触碰瓶壁或掉液。每次更换移液管，每次插入摇瓶的移液管只能用一次。给摇瓶添加培养基时，拧掉瓶臂上的螺丝帽。小心插入移液管不触碰瓶壁添加培养基。从摇瓶的瓶臂小心移动出液管，避免触碰瓶壁或掉液。每次更换移液管，每次插入摇瓶的移液管只能用一次。培养基因素：与杆状病毒作用：与杆状病毒或野毒株作用时，细胞培养和病毒作用的培养基要分开。杆状病毒粒子能在4℃存活和维持，在传代过程中会通过给培养板或方瓶加液污染细胞。-5-TECONTECHNOLOGYCENTERNOVALIUGrace's昆虫培养基/TNM-FH:●Grace's昆虫培养基:Grace's昆虫培养基,非补充培养基单独从Invitrogen获得（货号11595-030）。注意：此培养基含L-谷氨酰胺。●含补充添加物的Grace's昆虫培养基：含补充添加物的Grace's昆虫培养基单独从Invitrogen获得（货号11605-094）。其补充添加TC酵母和乳清水解物。补充添加培养基与TNM-FM有关（粉纹夜蛾）。●完全TNM-FH培养基:不添加10％胎牛血清的TNM-FH不能认为是完全培养基。血清提供营养以及在摇瓶中从流体压力下保护细胞。●血清敏感性：在使用之前血清无需预热。但是血清质量对细胞昀佳生长状态较重要。来自不同供应商或同一个供应商不同批次的血清质量变化较大且影响细胞生长昀佳状态。在所有昆虫细胞培养前强烈推荐检测新批次等份试样血清。更多血清敏感信息见疑难解答第30页。●pH：TNM-FH和Grace's昆虫培养基不含pH指示剂。对于Sf9在这种培养基中正常pH为6.2。和哺乳动物细胞培养不同，pH随细胞生长逐渐升高，但通常不会超过6.4。●稳定性：TNM-FH完全培养基在4℃可稳定放置一个月。●抗生素：许多抗生素适用于昆虫细胞。通常在存贮培养用10µg/mL庆大霉素在培养基中。下表总结了昀常用抗生素工作浓度和作用机理。抗生素工作浓度使用方法庆大霉素10µg/mL阻止细菌蛋白合成两性霉素B0.25µg/mL固定