干细胞生物学(博2014)

医学免疫学2014.10研究生讲座Keyword:StemcellMedline检索“Stemcell”共查到文献202,658篇Google搜索“Stemcell”共搜到相关网页51,300,000(截止8AM；2012.5.26)•干细胞概述•胚胎干细胞的基础与临床•造血干细胞的基础与临床•干细胞研究的现状与展望主要内容一、干细胞概述干细胞研究背景早期胚胎发育的一般概念干细胞基本概念干细胞研究的背景国家“十五”重点研究领域(基础)基因组学、信息科学、纳米科学、生态科学、地球科学基因组学基因组学（genomics)蛋白质组学（proteomics）细胞基因组学genomics基因蛋白质细胞基因组（genome）生物的全部基因和染色体组成,是所有遗传信息的总和;人类基因组含3-3.5万个基因基因组学(genomics)分析所有基因的结构（人类基因组图）、核苷酸序列、定位、功能（疾病及调控基因）、基因组遗传学语言（遗传指令、遗传语文及其外输的编辑）疾病基因组学*决定疾病发生的所有基因*基因是多数疾病的主要病因：单基因病、多基因病、获得性基因病基因组药物基因序列数据→新的基因全长cDNA→真核细胞瞬时表达→功能初筛和验证→重组基因稳定表达→体内外药效分析→临床前研究→临床验证→新药证书（传统的药物筛选：蛋白→功能→药物）蛋白质组学（proteomics）（后基因组学）基本概念蛋白质组（proteome）*一种细胞内所存在的全部蛋白质.蛋白质组学*在整体水平上研究细胞内蛋白质组成及其翻译、表达、调控的规律.功能蛋白质组学*特定时间、环境和实验条件下活跃表达的蛋白质.细胞细胞间相互作用蛋白的分子识别细胞间信息传递细胞生物学作用的机制蛋白大分子相互作用细胞内信息传导干细胞生物学SC定向分化特定组织干细胞特定组织细胞组织工程制备特定器官和组织早期胚胎发育的一般概念早期胚胎发育的过程精子与卵子结合双倍体合子（单细胞）卵裂（不生长，连续分裂）形成细胞团（桑椹胚，morula）囊胚（含囊胚腔、滋养层、内细胞群）细胞分化（celldifferentiation）*细胞后代形态、结构和功能发生差异的过程;*细胞的分化在高度精密的调控下有序地进行.*受精卵有分化为各种组织/细胞的潜能形成完整个体（含200余种不同类型细胞）*随胚胎发育，高等动物细胞由全能多能单能*分化细胞的胞核仍为全能性，含物种全套基因.(克隆动物的理论基础)定义*具有自我更新、高度增殖及多分化潜能的细胞;能产生表型和基因型均完全相同的子代细胞;是机体其他细胞的起源细胞。生物学特点SC分裂SC（不分化，含细胞分裂的功能蛋白）分化为功能单一的细胞（含分化蛋白）分类（按干细胞发育潜能）*全能(totipotency)细胞(胚胎干细胞)*多能（pluripotency）细胞*单能（monopotency）细胞干细胞(stemcell)基本概念TotipotentcellPluripotentcell胚胎干细胞ICM或原始生殖细胞各种细胞类型造血干细胞骨髓血液细胞、神经细胞神经干细胞脑神经元、胶质细胞、血细胞间质干细胞骨髓肌肉细胞、骨骼、脂肪细胞干细胞分类干细胞类型来源分化潜力干细胞分类•全能干细胞(受精卵、胚胎干细胞)•具有自我更新并分化为任何类型组织细胞的能力。•多能干细胞•分化方向已确定的干细胞（如HSC、肝脏干细胞）•分化为特定组织。定向祖细胞（committedprogenitor）*多能干细胞分化的下游细胞；分化和自我维持、自我更新能力受限；干细胞特性仅能维持较短时间。Astemcell(S)givesrisebyasymmetricdivisiontoaprogenitor(P)withamorerestrictedproliferationpotential,whichdifferentiatesinresponsetoextrinsiccues.Thestemcellphenotypeisregulatedbyreciprocalshort-and/orlong-rangesignaling(thickcoloredarrows).WattandHogan,Science287:1427,2000前体细胞(precursor)*在发育过程中较另一细胞更早期的细胞（某些情况下泛指干细胞和祖细胞）组织专一干细胞*是特定组织的起源细胞，具发育潜能；*动物成体多数组织中保留有部分干细胞；不同组织来源的干细胞可能互相转化。神经干细胞神经元、胶质细胞骨髓环境脑部血细胞二、胚胎干细胞的基础与临床embryonicstemcell,ESCES细胞概述ES细胞生物学特征ES细胞研究进展和应用前景定义：从早期胚胎内细胞团(innercellmass,ICM)或原始生殖细胞(PGC)分离而来的高度未分化细胞（具有发育全能性），可被定向诱导分化为所有种类的细胞，形成（内、中、外三个胚层）复杂的组织、器官、甚至完整的个体。（一）ES细胞概述（二）ES细胞生物学特征1.具有类似胚胎的分化全能性；*分化出三胚层分化细胞；*注入同基因小鼠生成畸胎瘤2.具有种系传递功能（即发育全能性）*植入假孕受体鼠子宫可发育成嵌合体胚鼠；3.可用于遗传操作的最早期细胞（knock-out、knock-in）ES细胞的建系*小鼠ES细胞系的建立(Evens等1998,Science)*人类ES细胞系的建立(1998)；ES细胞的定向分化在通过改变培养状态或诱导方式（饲养细胞、分化诱导因子、分化抑制因子等）实现定向分化。ES在体外已可分化为造血细胞、神经细胞、心肌细胞、肌肉细胞、内皮细胞、脂肪及血管发生。DerivationoftheHumanEmbryonicStemCellLine(A)Innercellmass-derivedcells(B)H9humanEScellcolony(C)H9cellsobservedwithhighermagnification(D)DifferentiatedH9cellsintheabsenceofthefeedercells(Thomsonetal.,Science282:1145,1998)造血定干向细分胞化的（三）ES细胞研究进展与应用前景研究人或动物发育在临床医学中的应用有待解决的问题借助转基因、基因打靶、基因芯片、基因捕获（trapping）技术，并通过分析/调控ES细胞定向分化的微环境、细胞因子、基质细胞、胞外基质等，研究人与动物胚胎分化发育。*寻找决定胚胎细胞定型、分化的关键因素；*分析特定基因的发育功能；*寻找发育调控基因；*体外研究人胚胎发生、发育；ES用于研究人或动物发育转基因动物的建立通过对ES细胞发育及定向分化研究，阐明细胞的增殖、分化、发育、成熟、迁移、定居、衰老、凋亡、癌变等生理或病理过程。ES在临床医学中的应用1.ES细胞用于药理学研究ES细胞具有分化的广谱性，可模拟体内组织和细胞间复杂的相互作用，故可代替整体动物，作为评价新药及化学产品的毒性（致畸）与药效的检测系统。2.作为研究人类疾病发生、发展机制的模型，探讨有效和持久的治疗方法。3.作为临床细胞、组织、器官移植的最佳来源*组织/细胞移植的细胞源*ES细胞分化、移植取得突破的实例：ES（少突/星状）胶质细胞治疗髓磷酯疾病*克隆技术/组织工程开拓移植物来源新途径。取人多脏器特异性SC与三胚层形成期动物胚胎进行嵌合使新生动物具有人的某一个或几个脏器4。基因治疗的细胞源*修饰ES细胞基因矫正缺陷基因。如何使特定个体的体细胞变为ES细胞：1．治疗性克隆（therapeuticcloning）：用成人细胞核取代卵细胞核，在体外培养至囊胚期，然后从囊胚的内细胞层获得ESC，但不再植入子宫，即不会发育成胚胎；2．组织移植：用动物卵细胞作为人细胞核受体，培育后获得ESC；3．细胞杂交：融合人细胞核与ESC胞质。(FuchsandSegre,Cell100:143,2000)1。技术上的难度*成熟干细胞含量极微，分离和纯化困难，且数量随年龄增长而降低；*迄今未能从肺、胰腺、肾脏和成熟心脏等器官分离出干细胞；*对某些急性病，无足够时间进行培养；*ES极易分化为其他细胞；*体外将ES细胞发育为器官（即组织工程）的技术难度；干细胞临床应用的限制因素2．理论上的不确定性*人ESC能否被强制定向分化；*能否让培养中的所有ESC均按人们意愿同步分化；*ESC的中间细胞类型，如何界定、检测（特征性表面标志）和分离；*ESC分化的微环境，触发和控制细胞分化的条件和确切机制；*通过体外扩增以获得足量细胞时，如何保留ESC自我维持而不分化的特点；3．安全性（1）遗传缺陷病的遗传错误、或理、化、生物因素或基因突变造成DNA错误复制，其出现于供者干细胞中成熟干细胞可能含异常DNA。（2）核移植后的卵细胞可能产生的副作用*沉默基因激活、启动某些DNA表达、改变染色体结构等。（3）ES细胞移植可能形成畸胎瘤的倾向。*ESC具有全能分化性，故在同一条件下可分化为不同组织类型细胞→畸胎瘤）*对策：在ESC中设自杀基因，必要时启动；TeratomasFormedbytheHumanESCellsinSCIDMice(A)Gut-likestructure(B)Rossettesfoneuralepithelium(C)Bone(D)Cartilage(E)Striatedmuscle(F)Fetalglomeruli-likestructure(Thomsonetal.,Science282:1145,1998)干细胞与癌症发生*某些干细胞可能是癌症之源：致癌基因突变的积累是癌症发生的必要条件，干细胞具有近乎无限的自我更新能力，成为积累基因突变的主要细胞。*造血干细胞和大脑干细胞具有白血病细胞、脑肿瘤细胞相似的某些表面特征。*从脑肿瘤中分离出某些类似脑干细胞（同时具有癌细胞特征）的细胞；这些变异的干细胞可在培养皿中转化为类似原发肿瘤的组织*迄今抗癌疗法效果欠佳，其原因可能是：放疗与化疗仅杀死快速分裂的肿瘤细胞，但未能消灭数量较少、生长缓慢的癌症干细胞。4.ES细胞作为移植细胞源的组织相容性对策：*建立ESC库，提供覆盖主要HLA型别的ESC*对ESC的MHC进行遗传学修饰（如knock-out），建立普遍适用的“万能”供者细胞系（donorline）；*借助同源重组技术，将受者MHC导入ESC；*直接将受者MHC转入ESC。5．伦理学障碍*人的胚胎是否享有人的权利？*将胚胎细胞用于科研和临床是否符合道德？医学伦理原则：自主、无害、有利、公平三、造血干细胞的基础与临床（一）成熟（专能）干细胞概述（二）HSC生物学特征（三）HSC的临床应用（四）造血干细胞库的建立（一）成熟干细胞1.来源2.发育的异质性成人不同类型组织可分离出成熟干细胞•造血干细胞：从PBMC、骨髓、脐血分离；•神经干细胞：*特征：具有分化为神经元细胞、（少突/星型）胶质细胞潜能；能自我更新；有强分裂能力。*来源于发育中的胎脑和成年个体的脑组织。*易在体外培养，成为理想的转基因宿主细胞*NSC分化诱导调控机制研究（2000年重点项目）*肝脏干细胞：从成年动物胆管周围组织。特定组织成熟干细胞能发育成其它类型细胞。*小鼠神经干细胞植入骨髓多种类型血细胞。*大鼠骨髓干细胞形成肝细胞。*哺乳动物造血干细胞样的专能干细胞皮肤、肝、神经细胞或非造血干细胞。成熟干细胞发育的异质性（二）HSC生物学特征*造血干细胞(hemopoieticstemcell，HSC)：具有高度自我更新能力和多能分化潜能的造血前体细胞。来源：人胚胎期卵黄囊（第2周）、胚肝（第4周）、骨髓（5个月）；出生后骨髓为HSC主要来源；成年人HSC分布：红骨髓（为主，比例为1/104）、脾脏（1/105）、淋巴结、外周血（0.2/105）脐带血（1/105）。造血微环境：造血干细胞分化发育的必要条件：*激素、