李金明-临床分子诊断质量保证

临床分子诊断质量保证李金明卫生部临床检验中心浙江大学附二院2014.10.18.杭州临床分子诊断发展历程：几个里程碑1953年:DNA双股螺旋的发现1963年:放射免疫测定技术、核酸测序方法1972~1973年:重组DNA技术1983年:PCR测定技术1991-1993年:实时荧光PCR技术和芯片技术2003年：人类基因组计划基本完成。纳米和量子标记技术？后基因组时代的功能基因组学研究2011年-新一代测序技术分子诊断的概念采用分子生物学方法（基因扩增、测序、杂交、蛋白质组分析、代谢组学分析等）检测患者体内特定遗传物质的结构或表达水平的变化而做出的诊断。分子诊断的靶标包括DNA、RNA、蛋白质和小分子代谢物。诊断医学70%以上信息来自实验室诊断监测预后预测分子诊断是整个检验医学领域内发展最快、最有活力的，在疾病的诊断和治疗中往往有决定性作用！分子诊断对临床检验的划时代意义！方法实时荧光PCR方法（扩增阻碍突变系统法（AmplificationRefractoryMutationSystem，ARMS）、PCR-高分辨溶点曲线分析（HRM））PCR-杂交法（膜上、芯片[基因芯片]、乳胶颗粒[Luminex]）PCR-Sanger测序PCR-焦磷酸测序PCR-新一代测序？PCR-SSCP、RFLP、dHPLC等荧光原位杂交免疫组化涉及临床医生标本采集环节和实验室涉及实验室人员和临床医生涉及实验室涉及实验室质量控制主要内容实验室设计仪器设备正确使用与维护和校准试剂方法性能验证可操作性检测SOP制订非统计和统计室内质控室间质评或实验室间比对人员培训产物分析区空气流向空气流向空气流向空气流向缓冲间缓冲间缓冲间专用走廊工作流向扩增区标本制备区试剂准备区“各区独立注意风向因地制宜方便工作”实验室应根据自己的检验项目、所采用的检测技术平台和工作量来决定分区的多少及各区域的空间大小。至少具体需要多少个区，同样是“个体化”的，以“工作有序、互不干扰、防止污染、报告及时“作为基本原则。缓冲间的功能是“控制空气的流向”。生物安全柜可考虑“A2”。“无基因”或“无核酸”概念的重要性！！！样本号样本突变类型正确结果突变报告为野生野生报告为突变报告1个以上的阳性结果（含预期结果）报告错误突变结果（不含预期结果）检测失败样本检出率实验室数实验室比例KRAS-0112035485.7%2不适用52093.7%KRAS-0212065282.5%1不适用64092.1%KRAS-0312054571.4%2不适用124090.5%KRAS-04野生型6095.2%不适用300095.2%KRAS-0513015892.1%2不适用11193.7%KRAS-0612045384.1%4不适用03384.1%KRAS-0712025993.7%1不适用03093.7%KRAS-0812015790.5%2不适用21193.7%KRAS-0913016196.8%1不适用10098.4%KRAS-10野生型6298.4%不适用100098.4%2013年KRAS突变质评总体的检测情况各样本检出率大部分90%，假阳性结果较多。PCR-Sanger测序样本编号预期结果某研究所实验室KRAS-01G12VG12SKRAS-02G12CG12AKRAS-03G12RG12DKRAS-04WTG13AKRAS-05G13D野生型KRAS-06G12SG12VKRAS-07G12AG12CKRAS-08G12DG12DKRAS-09G13DG13DKRAS-10野生型野生型检测方法PCR-直接测序PT成绩9030样本编号预期结果某医院病理科实验室KRAS-01G12VG12VKRAS-02G12CG12VKRAS-03G12R野生型KRAS-04野生型野生型KRAS-05G13DG12D;G13DKRAS-06G12S野生型KRAS-07G12AG12AKRAS-08G12DGly12Asp35GAKRAS-09G13DG12D;G13DKRAS-10野生型野生型检测方法焦磷酸测序PT成绩9050焦磷酸测序实验室仪器设备及管理加样器：维护、校准扩增仪：维护、校准杂交仪：维护、校准测序仪：维护、校准芯片扫描仪：维护、校准恒温干浴仪或水浴箱：维护、校准离心机：维护生物安全柜：维护冰箱：维护理想的试剂试剂方法的性能验证及每批试剂的质检性能指标：重复性准确性（定量：回收率、标准物质等；定性：方法学比较等）线性范围（定量）分析特异性测定下限抗干扰能力“性能验证”（“verification”）定义“verification”：broadlyas“confirmationthroughtheprovisionofobjectiveevidence,thatspecifiedrequirementshavebeenfulfilled”.（广义为通过提供客观证据证明特定的要求得到满足）CLIAusestheterm“verification”：specificallytorelatetoconfirmationthatthelaboratoryusingatestcanreplicatethemanufacturer’sperformanceclaimswhenthetestisusedaccordingtothepackageinsert.（CLIA性能验证术语特指使用某特定检测试剂或系统的实验室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，能复现生产厂家所宣称的检测性能。）自建方法和自配试剂有严格的试剂制备SOP建立相应的性能指标：重复性、准确性、特异性、测定下限和抗干扰能力等应做成一个试剂盒的样子：名称、方法、制备日期、制备人、有效期等有使用说明书实验室质量管理的“灵魂”源于一些标准文件（如仪器试剂说明书、国际国内标准文件）和实验室实际工作经验积累。因此高于相关标准文件！！！SOP等于试剂盒说明书吗？标准操作程序（SOP）是实验室的“最高标准”！有可操作性的SOP是质量管理的“灵魂”！“文字”加“图片”的SOP能给我们带来什么？实验室质量管理的“精髓”查出异因采取措施保证消除不再出现纳入标准（SOP）预防！防止同样的问题出现第二次是质量管理的“精髓”！人是错误的来源？追根溯源往往是管理上的问题！出现问题怎么办？厦门买罐装汽油实名制个人购买需开两份证明-搜狐新闻.htm厦门公交要装自动爆玻器按下按钮一推玻璃就碎全面质量管理的工作循环:PDCA4个阶段，8个步骤第一阶段（Plan）有4个步骤：分析并找出问题；找出问题产生的原因；确定最主要原因；制定措施计划。第二阶段（Do）有1个步骤：执行计划第三阶段（Check）有1个步骤：检查计划执行情况。第四阶段（Action）有2个步骤：总结、制定标准（修改质量文件），以巩固提高；发现新出现的问题，转入下一PDCA循环。19PDCA的特点小环合成大环不断循环，阶梯式上升“A”是改进的动力之源20PDCAPDCAHBVDNA质控失控发现质控结果超出均值－3SD）结果的报告和解释遗传检测报告至少要包括的信息将报告与特定患者联系在一起的惟一编号咨询人员的姓名和联系方式与检测结果解释有关的特异的信息和检测性能检验项目及所使用的方法（包括检测范围及检测局限性）标本类型标本接收日期检测实验室名称，地点，包括咨询实验室检验结果根据检测特性和其它提供给实验室的信息对结果的解释报告批准人的签字实验室联系方式报告日期适当时，还应包括：建议的有资质的遗传咨询人员；对其他家庭成员的意义；进一步的检测建议MM20-A.(vol.32.No.15)Qualitymanagementformoleculargenetictesting,Approvedguideline