酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验Enzymeslinkedimmunosorbentassay简介1971年，瑞典学者Engvail和Perlmann、荷兰学者VanSchuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验。ELISA就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。该技术应用非常广泛，几乎所有的可溶性抗原-抗体系统均可用以检测。酶和抗体或抗原结合后，既不改变抗体与抗原免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观察，也可用分光光度计加以测定。呈色反应显示了酶的存在，从而证明发生了相应的免疫反应。所以，这是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克，甚至纳米水平上对其进行定量。基本原理先将已知的抗体或抗原结合在某种固相载体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检样本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法洗去多余的分离抗原-抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。1，固相载体固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器，不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多，最常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，加之它的价格低廉，所以被普遍采用。ELISA载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最为常用，专用于EILSA的产品称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异很大，因此，每一批号的ELISA板在使用前须事先检查其性能。常用的检查方法为：以一定浓度的人IgG（一般为10ng/ml）包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10%。2，包被抗原或抗体固定到固相载体过程称为包被(coating)。抗原或抗体蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用力。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。载体对不同蛋白质的吸附能力是不相同的，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。IgG对聚苯乙烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外，因此抗体的包被一般均采用直接吸附法。蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被。当抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，抗原与固相载体的直接吸附可使抗原决定簇不能充分暴露，在这种情况下，直接包被效果不佳，可以采用间接的捕获包被法，即先将针对该抗原的特异抗体作预包被，其后通过抗原抗体反应使抗原固相化。此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。不易吸附在聚苯乙烯载体上的非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式。例如，在检测抗DNA抗体时，需用DNA作为包被抗原，而普遍的固相载体一般不能直接与核酸结合。可将聚苯乙烯板先经紫外线照射（例如30W紫外灯，75cm照射12小时），以增加其吸附性能。固相载体先用碱性蛋白质，如聚赖氨酸、鱼精蛋白等作预包被，也可提高核酸的结合力。也可用亲和素生物素系统作间接包被，即用亲和素先包被载体，然后加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入酶联免疫试剂盒板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。抗心磷脂抗体的ELISA，酶联免疫试剂盒试剂一般采用这种包被方式。3，封闭封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。封闭是否必要，取决于ELISA模式及具体的实验条件。并非所有的ELISA均需封闭，封闭不当反而会使阴性OD增高。一般说来，双抗体夹心法，只要酶标记物是高活性的，操作时洗涤彻底，不经封闭也可得到满意的结果。特别是用单抗腹水直接包被时，因其中大量非抗体蛋白在包被时同样也吸附在固相表面，业已起到了类似封闭剂的作用。但在间接法测定中，封闭一般是不可少的。抗原抗体反应特点1，抗原抗体反应可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡。解离后的的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性，因此可用亲和层析法来提纯抗体或抗原（亲和层析纯抗体）。最适比例在恒定量的抗体中加入递增量的抗原可以形成抗体复合物。该反应曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。即出现假阳性或假阴性。特异性抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。这种特异性使免疫测定能在一非常复杂的蛋白质化合物中测定某一特定物质，而不需要先分离待测物。2，敏感性在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为5~10μg/ml，免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应相仿。而酶标记的免疫测定的敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平。方法类型酶联免疫吸附试验的主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、竞争法、捕获法等。1，双抗体夹心法：此法常用于检测抗原它是利用待测抗原上的两个抗原决定簇A和B分别与固相载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。本法只适用于二价或二价以上大分子抗原，而不能用于测定半抗原等小分子物质。抗体A待测抗原酶标抗体B包被物2，间接法测定抗体此法常用于测定抗体将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合后再与酶标二抗结合，形成抗原-待测抗体-酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体量成正比，属非竞争性反应类型。抗原待测抗体酶标二抗包被物此间接结合在固相上的抗原远离载体表面，其抗原决定簇也得以充分暴露。间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法，试验的特异性、敏感性均由此得以改善，重复性亦佳。间接包被的另一优点是抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。3，竞争法此法既可用于检测抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体用酶标抗原（抗体）与待测的非标记抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与待测物含量成反比。限量的的抗体酶标抗原样品抗原酶标多于样品显色程度深样品多于酶标显色程度浅显色程度与待测物含量成反比包被物4，捕获法（反向间接法）主要用于测定血清中某种抗体亚成分以目前最常用的IgM测定为例，因血清中针对某种抗原的特异性IgM和IgG同时存在，而后者可干扰IgM的测定。因此，先针对IgM的第二抗体(如羊抗人IgMμ链抗体）连接于固相载体，用以“捕获”样品中所有IgM；洗涤除去IgG等无关物质，然后加入特异性抗原与待测IgM结合；再次加入抗原特异的酶标抗体；最后形成固相二抗-IgM-抗原-酶标抗体复合物，加酶底物显色后，即可对待IgM进行定性和定量测定。针对IgM的第二抗体待测物其中含有IgM和IgG特异性抗原与IgM结合酶标抗体包被物IgG等无关物质被洗脱5，ABS-ELISAABS为亲和素、生物素系统的略语。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，可以连接更多的生物素化的分子，形成一种类似晶格的复合体。因此把亲和素和生物素与ELIS偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使其结合点充分暴露。另外，在常规ELISA中的酶标抗体也可用生物素化的抗体替代，然后连接亲和素－酶结合物，以放大反应信号。生物素-亲和素酶联吸附试验（BA-ELISA）：待检抗原与固相抗体反应后，再加入生物素化第二抗体，形成抗原-抗体-生物素化第二抗体复合物，然后与酶标亲和素作用，并通过底物而显色。抗体包被物待测抗原生物素化二抗酶标亲和素生物素-亲和素复合物酶联免疫吸附试验（ABC-ELISA）：抗体与待检抗原作用，再与生物素化第二抗体结合形成抗原-抗体反应体系，再加入亲和素与酶标记生物素按一定比例共温形成的亲和素-生物素-过氧化酶复合物（ABC），使之与生物素化抗抗体作用，此时，ABC中尚未饱和的亲和素结合部位可与抗抗体分子上生物素结合，从而形成ABC标记体系，最后通过底特显色。本法相当敏感，适用于检测微量抗体。抗体待测抗原生物素化的二抗生物素-过氧化酶包被物亲和素（从链霉菌中提取的链霉亲和素）具体步骤包被封闭加待测物加一抗，二抗，或抗原等显色包被用包被液稀释包被抗体至合适浓度，包被酶联板（聚乙烯微量反应板），每孔100μ。用保鲜膜包好，4℃过夜。如急用，包被2h后，清洗也可用，但最好过夜。次日弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。用PBST洗液，洗4~5次。每次在洗板机清洗酶联板上震荡2~3min后，在面巾纸上拍干后进行下一次清洗或下一步。包被液0.05MPH9.6碳酸盐缓冲液Na2CO31.59g；NaHCO32.93g；加蒸馏水至1000mlPBST洗液2000mlPBS+1mlTween-20PBS：NaCl8g；KCl0.2g；Na2HPO41.42g；KH2PO40.27g；加1000ml蒸馏水定容，调PH至7.4洗板机封闭用封闭液封闭，每孔100μ。室温下，在微量振荡器上，封闭2h。弃去孔内溶液，并在面巾纸上拍干。用PBST洗液，洗4~5次。（同包被）用保鲜膜包好，4℃可保存一个月。封闭液10%小牛血清（1ml小牛血清加到9ml1×PBS中混匀）。5%脱脂奶粉（用洗液稀释）脱脂奶粉也是一种良好的封闭剂，其最大的特点是价廉，可以高浓度使用。高质量的速溶食用低脂奶粉即可直接当作封闭剂使用，但由于奶粉的成份复杂，而且封闭后的载体不易长期保存，因此在试剂盒的制备中较少应用。加标准样及样品待测样或标准一抗：用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器上孵育2小时。清洗。二抗：用PBST洗液进行稀释到适合浓度，每孔100μl，包好保鲜膜。室温下，在微量振荡器上孵育1小时。清洗。注意抗体抗原反应比较快，一般1~2个小时就达到峰值。延长反应时间容易出现非特异结合，但反应时间不能少于1.5小时。二抗的使用浓度（一般，1：10000稀释）应当进行预实验确定，二抗的反应时间不能过长，容易出现非特异反应。一般，反应40~60分即可。OPD显色临用前取A液5.14ml，B液4.86ml加入OPD(邻苯二胺，在-20℃中保存）0.0040g（约4小片），溶解后加入50μl的30%H2O2，配成显色液。（OPD要充分混匀，否则容易出现个别孔颜色太深）显色液每孔100μ