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这是我最近实验遇到的问题，拿出来请教一下各位我的目的基因经real-timepcr验证，在病灶区和非病灶区中，20多对样本，两两对照，最低的表达差异也要高出10倍。但是我用western和组化研究蛋白时，发现表达几乎无差异。我在考虑可能是什么可能使得目的基因在mrna水平上变化如此之大（我认为这变化应该和我研究的疾病有关，可能是疾病的因，也可能是果，不然不会在疾病中表达差异这么明显这么一致，不知各位同意否），以便设计我下面的实验。我想出来的可能性：1、可能我的目的基因位于基因组拷贝数变化的一个区域内，可能是它相邻的基因在疾病中发挥了作用，但是我用real-time做过它相邻的基因，没有变化，因此我基本否认了这个猜测。2、也可能是另一种蛋白高表达引起了这个疾病，而这个蛋白可能同时又调控我研究的目的基因的表达，不知这样的猜测应该如何设计实验进行验证比较好？因为才疏学浅，只想到了这两种可能性，因为请问还有没有其他的可能性呢？望版上各位不吝赐教。首先建议验证qPCRassay的重复性和可靠性。2.有无在mRNA水平由于alternativesplicing而引起的两者水平不一致？关于这个问题，要分开两步来分析。第一，在mRNA水平，你用不同的样本、多次qPCR均有10倍以上的差异，相信你的结果是非常肯定的，这一结果不用怀疑；第二，在蛋白质检测水平，你用免疫组化与westernblot均证实该抗体的信号没有明显差异，个人觉得这个结果也应该比较肯定的；但是，两者的不一致导致你的怀疑，难以解释。从mRNA到蛋白一般来说很少出现这样的差异，至于alternativesplicing的可能，你可以认真检索一下该基因是否存在splicing而产生的多个transcriptor，而你的引物又刚好引起了这种差异。因为现在的引物设计软件是比较严谨的，这种原因可以分析出来。由于这个基因不是新的，所以很多信息都可以查到，这个问题很容易解决。到于蛋白质的检测要受到抗体特异性的限制，你所使用的抗体是否是国际公认的大公司所生产的，有没有其它文章已经使用过并且证明特异性很好；能否找一个该基因明显变化的细胞模型，然后用qPCR与western检验一下该基因的变化。还有一种非常低级、概率非常低的可能，就是你所买的抗体根本就不是你所需要的抗体，而是其它没有变化的蛋白的抗体，甚至是actin这类的内参，所以上面提到的用细胞模型来验证抗体的特异性也是一个原因。根据你的描述，我觉得基因表达和蛋白表达的结果都没有问题。因为对于基因水平，多次重复后，两者都相差10倍以上，而蛋白水平你又是通过WB（定量）和IHC（半定量）2种不同的检测方法后得到的一致的结果，因此毋庸怀疑。当然，如果你还在怀疑蛋白水平的话，建议你可以再试试采用放射免疫分析法或者elisa方法对蛋白水平进行定量分析，如果结果还是没有改变的话，那就完全证明蛋白的确没有变化。我们都希望实验出现阳性的结果，这样在写文章的时候就可以大写特写，否则，就无话可说，甚至认为这实验白做了，更有甚者，出现捏造或者篡改实验数据，人为地把实验结果改为阳性。其实，这种做法后果很严重，应该杜绝。首先，我有几个问题想自问一下：1、为什么一定要基因表达和蛋白表达都要有差异呢？2、为什么不可以基因表达有差异，而蛋白表达无差异呢？3、为什么不可以基因表达无差异，而蛋白表达有差异呢？4、为什么不可以基因表达和蛋白表达都无差异呢？带着这几个问题，我个人觉得：1、如果基因表达和蛋白表达都没有差异，可能说明在这种实验处理条件下，这个基因在转录水平和翻译水平上都不存在调节。还有另外一种情况是，可能和你处理的时间、剂量/程度以及采样的时间段有关。如果是后几种可能的话，那么你就要分别检测在不同处理时间、不同的剂量/程度及不同的采样时间段，来检测你样品中基因和蛋白的表达水平，最后才能定论了。2、如果基因表达和蛋白表达都有差异，很简单，这种结果是我们预期想要的，此时就可大写特写该基因的生理功能和调节作用了。3、如果基因表达无差异，而蛋白表达有差异。乍一看，有点矛盾，其实不然，对于这样的结果，我们可以解释为，在这种实验处理条件下，这个基因在翻译水平上存在调节，并且这个蛋白对这种病理性症状可能具有一定的调节功能，因为该基因蛋白表达有差异嘛。4、如果基因表达有差异，而蛋白表达无差异。对于这一结果，也就是楼主所反映的实验现象，乍一看，有点矛盾，而且也不好解释。仔细一想，其实不然，对于这样的结果，我们首先可以初步判断，在这种实验处理条件下，这个基因在转录水平存在调节，但是在翻译水平上不存在调节。为什么会只在转录水平存在调节呢？对于这个问题的解答，实际上就是回答在这种实验处理条件下，这个基因的转录调控了，也就是寻找这个基因的上游，存在哪些基因或者转录因子，参与了这个基因转录活性的调节。这个问题的解决有点难哦~，涉及到分子生物学的很多知识。1、如果这个基因比较经典，序列已经有了，并且已经大概知道了受哪些基因的调控，那么可以先将这个基因的调控区序列从基因银行里调出来，然后进行序列比对，找到这个基因的整个调控区有哪些关键基因的结合位点。2、找到结合位点后，然后要对这个基因进行克隆，将一些重要的结合位点截去，或者用错乱序列取代（即突变），然后进行质粒构建，重组，并将之连接到带有荧光报告基因的载体上。3、接下来进行细胞转染，并检测报告基因荧光素酶的活性，根据荧光素酶活性水平的差异，确定上游的哪些关键基因参与了在你的实验条件下，目的基因转录活性的调控。4、根据上述结果，你可以进一步采用敲除关键基因或者目的基因的手段，或者采用转基因动物，在体上进一步研究这些关键的调节基因或目的基因的生物学功能，如果实验结果是你想要得到的话，那么一切就OK了。当然，这些证明实验有点难度，但是，只要能够做出来，应该是一篇很好的文章了，可以说，投5以上的杂志应该问题很小了。我觉得会不会还有以下的可能性：1、该蛋白质mRNA升高以后蛋白质也确实表达上调了，但是该蛋白的定位却有了变化，分泌出细胞了？2、虽然mRNA升高了（这说明转录步骤是上调的），但是另外还有控制该基因翻译的负调控因素被激活，这是很正常的，蛋白质的表达本身就是多步骤调控的结果，而且功能越重要的蛋白质其调控也就越复杂