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食品微生物检验规范操作基础培训2培养基的制备福建出入境检验检疫局技术中心食品所微生物实验室2010.05主要内容：§1清洗、消毒和灭菌操作§2培养基的制备§3采样和取、制样§4接种、分离纯化§5制片、染色及显微观察§6实验室安全基础知识§2培养基的制备培养基是指以液体、半固体或固体形式，包含天然或合成成分，用于促进微生物的繁殖或保持其活力的物质组成。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。2.1培养基的分类2.1.1根据培养基的组成来源不同来区分:天然培养基;合成培养基;半合成培养基。天然培养基天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料。如：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等优点：营养成分丰富，培养效果好，来源广泛.缺点：成分难以确切知道。合成培养基合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分精确、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。半合成培养基在合成培养基中，加入某种或几种天然成分；或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种培养基在生产实践和实验室中使用最多。固体培养基；液体培养基；半固体培养基。2.1.2根据培养基的物理状态来区分液体培养基所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂最为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。在实验室中，它被用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。半固体培养基把少量的凝固剂加入到液体培养基中，就制成了半固体培养基。以琼脂为例，它的用量在0.2～1%之间。这种培养基有时可用来观察微生物的动力，有时用来保藏菌种。运输培养基；保存培养基；增菌培养基。2.1.3根据培养基的用途来区分运输培养基在取样后和实验室样品处理前的时间，保护和维持微生物活性的培养基（如Stuart或Amies运输培养基）。运输培养基中通常不允许包含使微生物增殖的物质，但是培养基应能保护菌株，确保它们不变质。保存培养基用于在一定期限内保护和维持微生物活力，以防对微生物在长期保存中产生不利影响，或使微生物在长期保存后容易复苏的培养基（如Dorset卵黄培养基）。复苏培养基能够使受损或应激的微生物修复，使微生物恢复正常生长能力，但不一定促进微生物繁殖的培养基。增菌培养基大多为液体培养基，能够给微生物的繁殖提供较适当的生长环境，包括：A.选择性增菌培养基：能够保证特定的微生物在其中繁殖，而部分或全部抑制其他菌体生长的培养基（如SC、LST、RV等）；B.非选择性增菌培养基：能够保证大多数微生物生长的培养基（如M肉汤、营养肉汤）。分离培养基支持微生物生长的固体或半固体培养基，包括：A.选择性分离培养基：支持特定微生物的生长而抑制其他微生物生长的培养基（如PALCAM琼脂、TCBS、显色培养基等）；B.非选择性分离培养基：对微生物没有选择性抑制的分离培养基（如脑心浸液肉汤、营养琼脂）。鉴别培养基能够进行一项或多项微生物生理学和生化特性鉴定试验的培养基（如尿素培养基、Kligler琼脂等）；能够用于分离培养的鉴别培养基被称作分离/鉴别培养基（如XLD、DHL、TCBS等）。鉴定培养基能够产生一个特定的鉴定反应而不需要做进一步确认实验的培养基（如ONPG、氧化酶试剂）。用于分离的鉴定培养基被称为分离/鉴定培养基（如显色培养基）。显色培养基是在选择性培养基上加入了适量的带发色及荧光基团的酶底物，发色团（荧光团）与特殊酶可识别的基团相连。目标微生物产生一些特殊的可水解发色及荧光底物的酶，使得发色和荧光基团释放出来，从而使目标微生物带上易于辨别的特殊颜色或发出荧光。多用途培养基同时具有多种不同用途的特定培养基。例如，血琼脂是一种复苏培养基，又是分离培养基，还可作为溶血实验的鉴别培养基。(1)即用型培养基：以即用形式置于容器中（如平皿、试管或其他容器）供应的培养基。(2)商品化脱水合成培养基：不立即使用的干粉形式的（如粉末、小颗粒、冻干等形式）培养基。溶于水后能制备成一种或两种类型的培养基：a)完全即用型培养基：不需要添加其他成分的培养基；b)不完全即用型培养基：使用时加入不稳定成分。2.1.4根据培养基的制备方法不同来区分2.1.5实验室制备个别成分培养基实验室按照培养基配方逐一称取个别成分，按照培养基制备程序进行。2.2培养基的制备正确制备培养基是微生物检验的一个基本步骤。在处理脱水培养基和其他含有有害物质（如胆盐或其他选择剂）的培养基时，应遵守良好实验室规范（GLP）和生产厂商的注意事项。使用商品化脱水合成培养基制备培养基时，应严格按照厂商提供的使用说明配制，如质量（体积）、pH、制备条件、灭菌条件、操作步骤等。当使用独立成分制备培养基时，按配方准确配制并记录所有配制步骤。另外，记录所有使用成分的特性（如代号和批号等）。（1）水配制培养基应使用蒸馏水或相同质量的水，目的是排除抑制或影响微生物生长的物质。为保证蒸馏水的质量，蒸馏水的电阻率最少应达到0.3MΩ/cm。建议不使用未经过微生物含量检测的水（细菌总数应小于1000CFU/mL）。（2）称量和复水称量所需的脱水培养基（注意缓慢操作，必要时佩戴口罩或在通风橱中操作，以防吸入含有有毒物质的培养基粉末），先加入少量的水，充分混合（注意避免培养基结块），然后再加水至所需的量。（3）溶解和分装脱水培养基加水后适当加热，并不停搅拌使其快速溶解，必要时，重新溶解。含琼脂的培养基在加热前应先浸泡几分钟。由个别成分制备的培养基应将不同成分分别加入适量的水中，并充分溶解，然后再加水至所需的量。（4）pH的测定和调整用pH计测pH，必要时进行调整。在实验室用个别成分制备的培养基，除特殊说明外，培养基灭菌并冷却到25℃时，培养基的pH变化不应超过0.2个pH单位。一般使用大约浓度为40g/L（约1mol/L）氢氧化钠溶液或浓度约为36.5g/L(约1mol/L)的盐酸溶液进行培养基pH的调整。值得注意的是，商品化的培养基在高压灭菌前后的pH可能变化很大，但使用质量好的蒸馏水或去离子水配制时，灭菌前并不需要调节pH。（4）分装将配制好的培养基分装到适当的容器中，应按使用的目的和要求，分装于试管、烧瓶等适当容器内，分装量不得超过容器装盛量的2/3。容器口可用垫有防湿纸的棉塞封堵，制作的棉塞应紧贴管壁，不留缝隙，以防外界微生物沿缝隙侵入，棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，试管不下落为准。棉塞的2/3在试管内，1/3在试管外。分装容器应预先清洗干净并经干烤消毒，以利于培养基的彻底灭菌。此外还须用防水纸包扎（目前试管一般多有用螺旋盖，采用金属或塑料试管帽），分装时最好能使用半自动或电动的定量分装器。分装琼脂斜面培养基时，分装量应以能形成2/3底层和1/3斜面的量为恰当。每批培养基应另外分装20mL培养基于一小玻璃瓶中，随该批培养基同时灭菌，作为测定该批培养基最终pH之用。培养基和试剂的灭菌通常采用湿热灭菌或过滤灭菌。但有些特殊培养基（如嗜盐琼脂培养基、MKTTn、科玛嘉弧菌显色培养基等）只能煮沸灭菌。煮沸后应迅速冷却，避光保存；明胶、血清、糖类等不耐高温的物质，应采取高压锅低温灭菌法（间歇灭菌法）灭菌；有些试剂不需灭菌，可以直接使用（参见相关国际标准或供应商使用说明）。所有培养基湿热或过滤灭菌后,必须进行监测,尤其是要对pH、颜色、无菌效果和均匀性等指标进行监测。（6）灭菌制备含有有毒物质的添加成分（尤其是抗生素）时，需要特别小心（必要时在通风橱内操作），避免因粉末的扩散造成实验人员过敏或发生其他不良反应。制备溶液时要特别小心并按产品使用说明操作，不要使用过期的试剂。对于抗生素工作溶液，应当现用现配。在特定环境下，抗生素溶液应适量分装后冷冻储存，但解冻后的溶液不能再次冷冻，生产厂商应提供冷冻对抗生素活性影响的有关资料，也可由使用者自行测定。（7）添加成分的制备2.3培养基的使用(1)琼脂培养基的融化将培养基放到沸水浴中或使用有相同效果的方法（如高压锅中的蒸汽）使之融化。经过高压的培养基尽量减少加热时间以保证培养基的质量。避免过度加热，培养基融化后即可将其从加热器上取下，放入47℃±2℃的恒温水浴锅中冷却，直至使用。融化后的培养基应尽快使用，放置时间一般不应超过4h。(2)培养基的脱气必要时，将培养基在使用前放到沸水浴或蒸汽浴中加热15min，加热时松开容器的盖子；加热后盖紧盖子，迅速冷却至使用的温度。(3)添加成分的加入对热不稳定的添加成分应在培养基冷却至47℃±2℃时再加入。在加入灭菌的添加成分前，先放置到室温，避免冷的液态造成琼脂凝结或形成片状物。将加入培养基的所有添加物缓慢充分混匀，然后尽快分装到要使用的容器中。(4)培养基斜面和平板培养基的制备和储存琼脂斜面培养基应在灭菌后立即取出，冷至55℃-60℃时，摆置成适当斜面，待其自然凝固。斜面长度不超过试管长度1/2为宜。如制作半固体或固体深层培养基时，灭菌后则应垂直放置至冷凝。制备平板培养基，将融化的培养基倾注到平皿中，使之在平皿中形成一个至少2mm厚的琼脂层（对于直径90mm的平皿，通常需要加入15mL琼脂培养基）。将平皿盖好盖子后放到一个凉的水平平面使琼脂冷却凝固。在培养过程中，培养基会损失水分，当水分损失的量大于培养基总量的15％时，就会影响微生物的生长。凝固后的培养基应立即使用或存放于暗处和（或）放在4℃～12℃冰箱的密封袋中，最多存放一周或按厂商提供的标准执行。在平板底部做好标记，标记的内容包括制备日期和（或）有效期和名称，也可以使用培养基的编码系统进行标记。将倒好的平板放在密封的袋子中冷藏保存可延长储存期限。为了避免产生冷凝水，平板应冷却后再装入袋中。储存前不要对琼脂培养基表面进行干燥处理。对于采用表面接种形式培养的固体培养基，应先对琼脂表面进行干燥；干燥时，将平板盖揭开，将平板倒扣于烘箱（培养箱）中（温度设为20℃～50℃），或放在有对流风的无菌净化台中，直到培养基表面的水滴消失为止。注意不要过度干燥，商业化的平板琼脂培养基应按照厂商提供的说明操作。(5)培养培养时每垛最多堆放6个平板，平板间要留有空隙以进行空气流通，使培养物的温度尽快与培养箱温度达到一致。对于液体培养基，培养基温度与培养箱达到一致取决于很多因素，如体积、内容物量、容器类型、培养类型等。在使用厌氧罐时，有时堆放的平板数可以超过6个。(6)培养基的弃置所有污染的和未使用的培养基的弃置应采用安全的方式，而且要符合国家和地方法规的规定。2.4成品的质量控制(1)物理质量的控制实验室测试至少应包括以下内容：20℃～25℃时的pH；观察以下内容：加入培养基的量和（或）琼脂层的厚度；色泽；透明度和（或）是否存在肉眼可见的杂质；凝胶稳定性（粘稠度）和湿度。(2)微生物指标控制A.污染检测：在每批制备好的培养基选取部分样品进行污染测试。B.测试菌株：具有代表性的稳定特征并能有效证明实验室培养基最佳性能的一套菌株。测试菌株主要购于标准菌株保藏中心，也可以是实验室自己分离的具有良好特性的菌株。最好使用从事品种分离的菌株。包括：阳性菌株、阴性菌株等。C.即用培养基和试剂：应由商品化即用培养基的生产厂，向使用者提供相应的资质证明。使用者就不必对培养基进行大量的培养基测试工作，但应保证其储存条件。D.商品化合成脱水培养基制备的培养基：对于每批制备好的培养基，除用有效菌株进行测试外，还应用实际样品进行检测，以更好地证明。不含指示剂的培养基，只需用阳性测试菌株进行检测。含有指示剂或选择剂的培养基，应使用能证明其指示或选择