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相位荧光技术简介1852GeorgeGabrielStokesrenamedthephenomenon“fluorescence”resultedfromabsorptionoflightfollowedbyemission1926AccuratefluorescencelifetimemeasurementswerefirstachievedbyEnriqueGaviolaTime-resolvedfluorescencespectroscopyhasbecomeanindispensabletoolinthestudyoffastkineticprocessesinthesubpicosecondtomicrosecondtimescale.1.Background测量瞬态过程需要用持续时间远小于被测过程特征时间的脉冲激发源，相移法是利用相位变化测量荧光寿命，不同于脉冲法，它要求的仪器相对简单。激发源常采用正弦调制的光源，频率和调制度在一定范围内可调。样品被激发后发出的荧光也是调制光，不过相位和调制度相对于激发光都有了变化。测量这些变化，就可以解析出荧光寿命1.Background1：LEDanddriver；2：Sample；3：Spectrometer；4：Photomultipliertube；5：Digitaloscilloscope；6：ComputerExperimentalSetup实验装置主要包括光源、荧光信号探测系统和数据采集记录系统。LED是经过正弦调制的光源；光谱仪、光电倍增管及其电源组成了荧光信号探测系统；检测器和计算机构成数据采集记录系统。2.实验装置对于单分子发光过程，用一个短脉冲光δ(t)激发样品后，发光强度随时间按指数规律衰减一般，如果一个线性系统在δ(t)激发下的响应为K(t)，那么，系统对任意形式的均匀弱激发e(t)的响应F(t)可以表示为设激发光是正弦调制的稳态下它的发光强度正比于调制度tan荧光寿命3.荧光寿命的测定Relativephaseshiftandmodulationoftheexcitationandemissionlightinfrequencydomainfluorescencespectroscopy.参数A表示直流分量，B，为调制波的振幅，f是调制波的频率，t0代表初始相位激发光经过正弦调制后在检测器上显示的波形可通过如下方程拟合得到左图右侧虚线代表实测的荧光强度随时间的变化。由前所述，通过特定正弦调制后的激发光激发下得到荧光强度方程可用下式表示，进而可拟合得到荧光寿命τ3.荧光寿命的测定对于多组分或单一组分拥有多个荧光中心的样品，发光总强度计算如下Pj，τj分别为荧光体系的第J个指数分量的幅度以及衰减时间,角频率fk的简谐波由调制的激发源激发，其变化范围可达1-160MHz（1984年）由每个频率fk，可得到两个含有2N个未知数的方程。改变频率，进行M次测量，就可以通过拟合得到Pj，τj3.荧光寿命的测定对于一个给定的波长λ，当φD=φ时，光强积分有最大值(inphase)当φD=φ±90ͦ0该组分的发射被抑制,称为nullphaseangle中间范围内的积分值介于两者之间将F(t)*P(t)积分，得到下式4.多组分样品的测量Phase-resolvedfluorescencespectroscopy(PRFS)Foramulticomponent,heterogeneoussystemofjindependentemitters,thephase-resolvedintensitiesareadditive4.1Directnulling方法用于选择性去除某一物种的光谱，需要已知该物质或相应的标准物质的光谱对于未知样品，需要调整检测器的相角，0-360度，以消除特定组分的光谱，进而可用于检测多重组分的稳态光谱但directnulling方法需调节检测器费时费力，且无法有效区分荧光寿命十分接近的样品其他使用PRFS来解决多组分样品的方法还有：IndirectNullingSimultaneousequationmethod等几种PRFS方法检测POPOP和dimethylPOPOP的误差比较4.1其他方法Reference1.ANALYTICALCKMISTFIY,VOL.56.NO.13,NOVEMBER19842.ANALYTICALCHEMISTRY,VOL.57,NO.8,JULY19853.Photochem.Photobiol.Sci.,2008,7,1301–13124.荧光寿命的正弦调制测量法及分析2007