液相色谱手册：液相色谱柱与方法开发指南

液相色谱手册液相色谱柱与方法开发指南液相色谱手册液相色谱柱与方法开发指南2前言4色谱的基本概念5柱效(N)6保留因子(k)7选择性或分离因子(α)7分离度(Rs)8压力9vanDeemter曲线10梯度方程10HPLC柱的选择12HPLC模式13色谱柱选择的基本信息：常规柱14•高效液相色谱(HPLC)柱15•UHPLC柱16•表面多孔填料柱16•LC/MS柱17•快速色谱/纯化柱18•凝胶渗透色谱（GPC）柱、体积排阻色谱（SEC）柱和凝胶过滤色谱（GFC）柱19•生物表征柱19色谱柱的特性20•硅胶20•键合相20•聚合物20•孔径21•粒径21•色谱柱规格22卡套柱系统23性能的关键：色谱柱的配置和设置26减少柱外体积的重要性27使用良好的连接接头28•进行良好的连接29进样31设置数据采集速率32驻留体积及其对色谱的影响33•测量系统的驻留体积35•评估驻留体积的影响37•驻留体积与分析时间38螯合物38pH与流动相改性剂39梯度操作40优化色谱柱的再平衡41色谱柱老化43•键合相流失43清洗反相硅胶柱43清洗正相硅胶柱45清洗反相聚合物柱45方法开发46方法开发：从何处入手47•模式选择47•选择色谱柱和填料规格50•选择固定相51反相色谱的方法开发51反相色谱固定相的选择51反相色谱流动相的选择54•流动相操作54•流动相和流动相改性剂问题排查54目录3•流动相混合55•流动相脱气55用流动相改性剂控制pH55•UV检测器常用的缓冲液57•LC/MS的考虑因素58•流动相改性剂问题排查60•问题排查实例：基线漂移60•问题排查实例：高pH造成的峰展宽和峰分裂62•问题排查实例：流动相改性剂与选择性62优化反相色谱条件64•等度优化65•梯度优化68用于反相色谱的聚合物色谱柱70反相色谱等度方法开发步骤指南71从常规柱向高效柱进行方法转移的技巧73自动化方法开发工具75其它HPLC模式的方法开发77•HILIC77•正相色谱79•离子交换色谱81•凝胶渗透色谱/体积排阻色谱82色谱结果的保护83样品制备84•样品过滤84•固相萃取85•液-液萃取(LLE)86•支持液膜萃取(SLE)87•QuEChERS88使用高纯度级别溶剂的重要性89UHPLC的特殊考虑89在线过滤器90•低体积在线过滤器90保护柱91溶剂饱和柱91色谱柱入口筛板91色谱柱保护和保存91•最大限度延长柱寿命91•保存注意事项93•疏通色谱柱93色谱柱变坏时的快速检查93确保方法在全球范围内都重现94•提高方法的耐用性94•有关驻留体积的提示95快速故障排查指南96有效排查故障的要点96有用的参考资料102美国药典指定填料102溶剂相溶性108流动相改性剂的UV截止波长111固相萃取吸附剂112SPE吸附剂条件113其它推荐的读物114其它安捷伦资源114词汇表115索引142订购信息1484前言从何说起呢？液相色谱是一个庞大而复杂的话题，但也是一个我们永不会失去兴趣的话题。遍及世界各地的色谱工作者正在使用HPLC技术，确保我们食物和水的安全、开发挽救生命的药物、保护我们的环境、保卫公共健康，而这仅仅是其应用的一角。您对色谱技术了解得越多，您能应用这一神奇技术所能做的工作就越多。如今，有更多的色谱柱和填料供您选择，以适应日益广泛的应用需求。安捷伦现在有2000多种色谱柱可供选择，覆盖了最广泛的应用和条件。这就增加了根据您的需要选择最适用色谱柱的机会。帮助您得到最好的液相色谱结果是我们承诺的一部分，因此，我们编制了这本液相色谱柱选择手册，其中包含了大量的提示和技巧，让您的工作更轻松、更高效。另外，我们还以40多年积累的经验为基础，为您提供色谱柱和接头日常使用中常见的问题提供建议。本指南涵盖了液相色谱中的主要色谱柱，重点是反相高效液相色谱。如何使用本指南：•为便于查询，各章节有不同颜色标记。•附加的词汇表非常全面。虽然限于篇幅，我们没能收录本书中的每个词汇术语，但仍不失为良好的资源。•虽然本书也涉及了其它技术，但重点是反相HPLC。5色谱的基本概念我们都还记得在学校里学习数学的感觉，总是想知道怎么把它用到实际生活中去。科学家们要比专业人员学习更多的数学，本章将告诉我们其中的原因。这里，我们将简要概述一下色谱概念所涉及的公式和理论。对这些概念的理解将帮助您获得最好的结果，并在遇到问题时进行排查。我们将从以下的性能基本概念开始：•柱效•保留•选择性•分离度•压力这些都是理解如何优化结果、成功开发方法的关键。我们还将探讨一些较复杂的概念：•vanDeemter曲线•梯度方程这两项内容对方法开发也很重要。6塔板数高的色谱柱柱效更高。理论塔板数高的色谱柱与理论塔板数低的色谱柱相比，在给定保留时间内的色谱峰更窄。柱效(N)柱效用于比较不同色谱柱的性能。柱效可能是描述色谱柱性能引用频率最高的参数，以理论塔板数N表示。柱效N=16(tR/wt)2对于色谱峰B，16(4.5分钟/0.9分钟)2=400塔板数k=(tR-t0)/t0保留kA=(2.5-1)/1=1.5kB=(4.6-1)/1=3.6kC=(6.2-1)/1=5.2选择性α=k2/k1α=kc/kb=5.2/3.6=1.44α=1.44图1.柱效、保留因子和分离度的色谱示意图方程1.柱效方程峰底宽柱效保留时间方程2.计算柱效的变换方程半峰宽保留时间检测器响应7如果我们在约4σ峰宽处做切线，并测量tw距离，就可以用方程1计算色谱峰B的理论塔板数，N=16(tR/tW)2。有时，4σ峰宽很难测量（如，基线噪音较大时），可以使用变换方程（方程2），测量半峰宽（w1/2):N=5.54(tR/w1/2)2。高柱效的好处很大，即使选择性较低也可以分离窄峰。柱效受柱参数（内径、柱长、粒度）、洗脱液类型（特别是粘度）、流速或平均线速度的影响。柱效还受化合物及其保留的影响。常使用每米理论塔板数（N/m）进行色谱柱的比较，但需要在相同的色谱温度条件和峰保留（k）下进行。对于α较小的固定相，柱效对分离更为重要。保留因子(k)过去称为容量因子或k′（k值），保留因子是指样品组分停留在固定相中相对其驻留在流动相中的时间之比。用保留时间除以峰不保留时间（t0）进行计算。选择性或分离因子(α)分离因子是对两个色谱峰之间时间或距离的最大测量值。如果α=1，则两个色谱峰具有相同的保留时间并共洗脱。方程4.选择性方程第二个峰的保留因子选择性因子第一个峰的保留因子方程3.保留因子方程保留因子峰不保留时间样品峰的保留时间8选择性因子的定义是容量因子之比。在图1中，您会看到，峰A和峰B之间的选择性比峰B和峰C的选择性更好。图中提供了计算说明。改变流动相或固定相都可以改变选择性。温度也是调节选择性的一个因素。分离度(Rs)分离度代表色谱柱分离目标峰的能力，因此，分离度越高，两峰之间越容易得到基线分离。从方程5中可以看出，分离度与柱效、选择性和保留值相关。可以通过改善这些因素来提高分离度。在图2中，我们可以看到每个参数在分离过程中的不同作用。所有这些参数都呈效应递减趋势。即取值越大，对分离度的影响就越小。如果将柱长加倍，将得到更多的理论塔板数，但分离时间也将延长2倍，而分离度只能得到2的平方根即1.4倍的提高。如果要对色谱峰进行定量，那么分离度最小应等于1。分离度要达到0.6，才能分辨两个等高峰间的峰谷。如需建立耐用方法，理想分离度值一般应大于等于1.7。基线分离并确保最准确定量结果的分离度应为1.6。方程5.分离度方程9压力压力方程（方程6）包含影响系统压力的5个重要参数：溶剂粘度(h)、流速(F)、柱长(L)、色谱柱半径(r)和填料粒径(dp)。熟悉压力方程将能很好地理解这些重要参数对系统压力的影响。从公式中可以看出，粒径(dp)稍微降低就会对反压造成明显影响。图2.分离度为选择性、柱效和保留值的函数选择性对分离度的影响主要是通过：•改变键合相•改变流动相塔板数是最容易增加的分离度塔板数选择性增加N增加选择性增加k方程6.压力方程压力的改变粘度流速柱长柱渗透性柱半径粒径10我们经常通过绘制vanDeemter曲线评价不同色谱柱的性能，并理解如何根据方法进行线速度的优化(uopt)。梯度方程当样品中存在各种类型的组分时，我们很难用等梯度洗脱（即，恒定流动相组成）在适当时间内让所有组分都得到分离。梯度洗脱是一个随时间提高流动相强度的过程，最终使分析速度更快、峰形和定量结果更好。通过梯度洗脱，峰宽通常将更窄，并保持恒定（有关梯度洗脱的更多信息，请参见第40页）。梯度方程（方程8）显示了影响分析的关键因素，如果忽视它们，可能会给色谱分离带来问题。该方程显示了流速（F）、梯度时间（tG）、梯度范围（DF）和柱体积（VM）对保留因子的影响。切记，为保持保留因子恒定，如需改变分母则需按比例改变分子，反之亦然。方程7.vanDeemter方程vanDeemter曲线vanDeemter方程是将柱效作为线速度（u）或流速的函数对柱效（用H表示，见方程7）进行评价。H–称为塔板高度，或理论塔板高度，用柱长（L）除以理论塔板数进行计算。我们的目标是得到小塔板高度。可以通过使用较小填料色谱柱、优化线速度，以及使用低粘度流动相，更有效地实现这一目标。随着粒径减小，优化线速度将增大。图3.vanDeemter方程图示塔板高度越小，塔板数越大，色谱分离度将越大大粒径填料小粒径填料总曲线：vanDeemter传质阻力涡流扩散纵向扩散塔板高度（H）线速度（u）11在梯度方程中，S为常数，与所分离的分子大小有关。小分子的S值约为4到6，多肽和蛋白质的S介于10到1000之间。现在，经常使用不同尺寸的色谱柱，或使其更短（例如，为实现更高通量），或使用窄内径柱（如，用于质谱检测）。必须按比例缩短梯度时间（tG）或减小流速（F），以补偿柱体积的减少。使用相同色谱柱时，如果想保持相同的梯度斜率和k*值，则需在梯度时间（tG）内按比例调整梯度组成（DF）改变速率或流速（F）。使用安捷伦方法转移软件是将方法转移到不同规格色谱柱时的绝佳方法。登录，输入“液相色谱方法转移器（LCMethodTranslator）”搜索得到方法转移器。增加保留因子k(或k*，在梯度中)是提高分离度的简便途径，但如图2所示，它并不如增加柱效和选择性更有效。如通过延长梯度时间增加保留因子，将使分析时间延长，如方程8所示。方程8.梯度方程流速梯度时间常数色谱柱死体积梯度保留值B溶剂体积变化12HPLC柱的选择色谱柱的选择一半是科学，一半是艺术。我们之所以这么说，是因为这里有一些确定的明了标准：与应用相适合的色谱柱固定相、与系统压力限相适应的规格等等。在多数情况下，预定义方法可能规定了特定的固定相或色谱柱规格，所以，选择色谱柱必须符合这些规格，确保来自可靠的、高质量色谱柱供应商（我们推荐安捷伦，但也可以选择别的品牌）。此外，方法开发可能更有技巧，在这个过程中要测试各种固定相和流动相的性能，以获得符合您应用需求的选择性。本节首先要回顾一些基本概念：•HPLC模式•常见的HPLC柱填料然后我们再来专门讨论现在最常用的主要色谱柱类型及其特点。•HPLC柱•UHPLC柱•表面多孔填料柱•LC/MS柱•快速色谱/纯化柱•凝胶渗透色谱（GPC）柱、体积排阻色谱（SEC）柱和凝胶过滤色谱（GFC）柱•生物表征色谱柱13如需了解各种模式之间差异的更多信息，请参见第47－49页。我们还将解释一些关键柱参数的重要性•填料–硅胶、键合相、聚合物•孔径•粒径•柱规格在本节的最后，我们将对现有卡套式色谱柱进行概要介绍，包括保护柱、半制备柱，以及制备和生产柱。本节资料应与包含更多色谱柱固定相和选择性信息的方法开发一节（第46页）中色谱柱选择部分结合使用。HPLC模式在开始评估色谱柱之前，最重要的工作是要确定HPLC模式。目前有很多常用的HPLC模式或技术：•反相•HILIC•正相•离子交换•体积排阻调查显示，一般而言95%的色谱工作者都在其工作中使用反相色谱，基于这一原因，本手册将把这项