菌种的生产与保藏

第三章菌种的生产与保藏菌种，好比农作物的种子，是食用菌生产的根本，其优劣直接影响食用菌的产量和质量。因此，从事食用菌菌种工作的单位都必须认真做好菌种的培育和保藏工作。一、菌种培育技术人工培育的菌种有母种、原种和栽培种之分。1）母种（一级菌种）：用孢子分离或组织分离等培育的菌丝体称为母种。2）原种（二级菌种）：把母种扩大到木屑、棉籽壳等为主的培养料上的菌种称为原种。3）栽培种（三级菌种）：由原种扩大培养成为生产上使用的菌种称为栽培种。4）菌种：实质上就是经过人工培养并进一步繁殖的食用菌的纯菌丝体。食用菌的制种程序组织分离接种→母种（一级）接种→→原种（二级）接种→→栽培种（三级）种菇孢子分离经过这样三级培养，食用菌菌丝数量大大增加。一般1支试管菌种可繁殖4~6瓶原种，每瓶原种又可扩大繁殖60~100瓶栽培种。培养培养母种原种、栽培种栽培种食用菌的制种程序菌种生产必须在严格的无菌条件下进行。为了保证制种的成功，除必须掌握制种技术外，还需要一些基本的设备和用品。1、接种设备⑴接种室要求:①关闭严密，便于熏蒸、消毒；②空间不宜过大，一般长、宽、高均为2m即可;③接种室外面最好有一个缓冲室；④墙壁、天花板和地面都要平整、光洁；⑤内装有紫外灯和日光灯。(一)菌种生产常用的设备和用具1、接种设备⑵接种箱当菌种生产量不大时，可在接种箱内进行。它是用木条作成框架，以3mm厚的玻璃作箱壁。要求：①关闭严密，便于熏蒸；②装有日光灯和紫外灯。优点：搬动方便，操作人员不会受有毒气体危害。缺点：容量小。1、接种设备⑶超净工作台原理：超净工作台是利用过滤除菌的原理，先将空气过滤，得到无菌空气，然后将无菌空气从风洞打出，使工作台范围内成为无菌状态。要求：放置工作台的房间要清洁，空气流动小，最好安装灭菌灯。优点：有效可靠，操作使用方便，在夏季接种时，使操作人员感到舒适。每台3000元左右，有条件的食用菌专业户，可选用这种先进的接种设备。超净工作台(一)菌种生产常用的设备和用具2、灭菌设备1）手提式：容量小，适于斜面试管及玻璃器皿等；2）立式：容量大，投资大；3）卧式：容量大，投资大；4）家用24或26cm压力锅：母种、原种培养基。Ⅰ高压蒸气灭菌锅优点：省时、省燃料、效果好2）、3）一般在菌种场或研究所应用。灭菌设备Ⅰ高压蒸气灭菌锅(一)菌种生产常用的设备和用具2、灭菌设备Ⅱ常压灭菌锅目前农村生产栽培种的必备设备，实际上是一种大型蒸笼式煮灶。底部为铸铁大锅，上部为圆形木桶，桶内装数层供放培养基的格架。桶盖装有活络搭及密闭的橡皮圈，由于锅内温度最高是100℃，所以灭菌时间需维持10~12h，才能达到灭菌效果。(一)菌种生产常用的设备和用具3、培养设备⑴培养室大小：不宜过大，一般以20℃~25℃，培养5000~6000瓶菌种为宜，太大不易保温和管理。要求：干净、通风、保温，应设有调温设备，使室温保持在20℃~25℃。门窗应设铁纱，以防鼠、虫为害。⑵生化培养箱是专业工厂生产的恒温电器设备，用于培养母种或少量原种，可以根据需要任意温度调节。(一)菌种生产常用的设备和用具4、培养菌种的容器母种：试管，常用规格20×180~200mm，18×180mm等。原种、栽培种菌种瓶：盐水瓶、罐头瓶菌种袋聚丙稀袋聚乙稀袋规格有：12~15×30~35cm，17×35~45cm母种-试管原种、栽培种—菌种瓶或塑料袋菌种瓶(一)菌种生产常用的设备和用具5、接种工具移植菌种于培养基上的工具称接种工具，主要有以下几种：接种针、环、刀、钩、铲、锄、枪等；(一)菌种生产常用的设备和用具6、常用的消毒药品⑴70%酒精：一般用于手、种菇表面消毒；⑵0.1%升汞：常用于玻璃器皿、非金属器械及种菇表面消毒；⑶0.1%KMnO4：一般用于用具、器皿消毒；(一)菌种生产常用的设备和用具6、常用的消毒药品⑷5%石炭酸：喷洒墙壁、地面及擦洗桌面等，也可用来苏尔代替；⑸2%来苏尔、新洁尔灭：用法同上；⑹甲醛（福尔马林）：用于菇房和接种箱等空气消毒；方法：关闭门窗消毒，自行气化；用量：10ml甲醛＋5gKMnO4／立方米。(一)菌种生产常用的设备和用具(二)母种生产技术1、母种培养基食用菌母种培养基的种类繁多，由于不同营养类型的食用菌对营养物质的要求不同，所以，在培养不同食用菌母种时，应选择适宜该菌种的培养基。母种培养基要求营养丰富、完全、氮源、维生素的比例应高。现将食用菌常用的母种培养基列举如下：(一)菌种生产常用的设备和用具(二)母种生产技术⑴配方①马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）马铃薯200g、葡萄糖（或蔗糖）20g、琼脂20g、H2O1000ml、pH6.5。适用于一般食用菌母种分离与培养，但草菇、猴头菌等在此培养基上生长不良。(二)母种生产技术②综合马铃薯培养基马铃薯200g、葡萄糖（或蔗糖）20g、KH2PO42g、MgSO40.5g、维生素B110mg、琼脂20g、H2O1000ml、pH自然。适合培养草菇、猴头菌、灵芝及各种食用菌菌种分离、保藏。(二)母种生产技术③胡萝卜葡萄糖琼脂培养基胡萝卜200g、葡萄糖（或蔗糖）18~20g、琼脂20g、H2O1000ml、pH自然。(二)母种生产技术④玉米粉培养基玉米粉40g、葡萄糖（或蔗糖）10g、琼脂20g、H2O1000ml、pH自然；适用于大多数食用菌菌丝的生长。⑤马铃薯、葡萄糖、蛋白胨、琼脂培养基马铃薯200g、葡萄糖（或蔗糖）20g、蛋白胨10g、琼脂20g、H2O1000ml、pH自然；适用于培养和保藏多种食用菌。(二)母种生产技术⑥黄豆芽、松针培养基黄豆芽250g、松针50g、葡萄糖（或蔗糖）20g、琼脂20g、H2O1000ml、pH5~5.5。将松针、黄豆芽按量称好，加水煮30min，取滤液，加入葡萄糖、琼脂，充分搅拌，使琼脂熔化，补水至1000ml，即分装试管。主要用于培养竹荪母种。(二)母种生产技术⑦苹果汁培养基苹果100g、蛋白胨2g、蔗糖20g、琼脂20g、H2O1000ml；主要用于草菇培养（配制方法同PDA）⑴配方⑵配制方法（以PDA为例）马铃薯（去皮、去芽眼）→切成片→称取200g＋1000mLH2O→煮沸→双层纱布过滤→取滤液并补足1000mL＋琼脂→熔化＋其它营养物质→调节pH（用HCl或NaOH）→分装试管→灭菌（高压蒸气灭菌15-30min）→制成斜面→检查灭菌效果（即28~30℃培养2~3d）其它天然培养基或综合培养基，如：玉米粉、黄豆粉、胡萝卜、麸皮等原料，加适量水煮汁过滤，取滤液与其它成分混合。(二)母种生产技术2、母种分离母种分离方法孢子分离组织分离基质分离有性无性⑴孢子分离法利用孢子在适宜培养基上形成菌丝来获得纯菌种的方法。孢子分离法1）单孢子分离法：培养基上只接种1个担孢子，使它萌发成菌丝体而获得纯菌种的方法。如：双孢蘑菇、草菇单个孢子分离得到菌丝便能结实。（一个孢子→萌发→菌丝体→纯种）2）多孢子分离法：许多孢子接种于同一培养基上，使它们萌发自由交配来获得纯菌种的方法。如：香菇、平菇、金针菇、毛木耳等。（多个孢子→萌发→菌丝体→纯种）(二)母种生产技术下面先解释二个基本概念1）同宗配合：同一担子孢子萌发产生的两条菌丝之间进行结合便能生育（自交亲合、可孕，类似于高等植物自花授粉），可用单孢子分离。如：双孢蘑菇、草菇2）异宗配合：同一性别菌丝之间不亲合，只有两条性别不同的菌丝交配才能产生子实体。大多数食用菌属此类型，需用多孢子分离法。(二)母种生产技术担子菌亚门中，约10%菌类属同宗结合，90%以上是异宗配合，所以单孢子分离对大多数食用菌不适用，只有育种时才采用。此法技术复杂，生产上很少采用，在此不作详述。(二)母种生产技术多孢子分离简单易行，生产上经常采用，多孢子分离的具体操作方法有以下几种：①整菇插种法：伞菌常用此法采得孢子。即选择成熟度适当的优良种菇，在无菌操作下，插入无菌孢子采集器内，置适温下让其自然弹散孢子。用接种环取少量孢子，放入试管斜面上培养。种菇选择：菌丝生长健壮，无病虫杂菌，出菇均匀，转潮较快，菇形圆整，菌盖肥厚，达八九成熟。参见P48(二)母种生产技术孢子采集器是用来采集食用菌孢子的一种装置。孢子采集器搪瓷盘（大号培养皿）培养皿种菇支架玻璃钟罩（大漏斗）参见P48②悬钓法此法主要用于耳类（黑木耳、毛木耳、银耳等）孢子的采集。耳片（表面消毒）→悬挂于培养基上方→培养→→取出挂钩与耳片→培养→挑取先端菌丝→转管纯化→母种12~24h培养基耳片参见P48组织分离：指通过菇体组织分离纯种。优点：操作简便、取材广泛、不易变异，保持原菌种优良种性。方法：①选择种菇（出菇早、无病虫害、柄短、肉厚、大小适中、5~6分成熟）②组织分离⑵组织分离法参见P45选择种菇→表面消毒（75%酒精或0.1%升汞）→撕成两半→取菌柄菌盖交界处→小块菌肉→移入PDA→培养→观察→转管→纯种上述分离物在25℃下，经3d~5d可看到分离物表面长出白色绒毛状丝，每隔1d~2d检查1次，随时淘汰霉菌、细菌污染的培养物，培养10d~15d，再作1次转管即得到纯种。⑵组织分离法参见P45-46注：⑴取组织块不要贪大，因组织块小易定植;⑵有些食用菌不易用组织分离法获纯种；⑶不同的食用菌切取部位和消毒方法不同。如：1）红菇、乳菇等，因它们菇体细胞已泡囊化，再生能力极弱；又如：2）银耳和木耳等胶质菌，它们子实体中菌丝含量极少，组织分离法不易成功。而只能取其生长的基质即菇木、耳木分离。⑵组织分离法概念：由菇木、耳木、培养料等食用菌生长基质中的菌丝分离培养而成。这是利用潜在于寄主组织内的菌丝体获得纯种的方法。（常用于银耳及木耳菌种分离）⑶基内菌丝分离法（基质分离法）参见P46-47段木内菌丝分离法：取1~2cm菇木、耳木（子实体着生部位）→去皮→消毒（75%酒精或0.1%升汞浸泡1min）→切去四周木块→切成火柴杆粗细，0.5cm长的小木梗→取1根放入试管斜面上→培养→取菌丝→转管纯化⑶基内菌丝分离法（基质分离法）参见P46-47母种(二)母种生产技术3、菌种提纯与扩大繁殖用孢子、组织或基质分离法得到的菌种，一般不宜直接用于生产，必须经过提纯方可应用。⑴提纯：选稀疏单菌落→边缘取菌→接种试管斜面（3~5支）→培养→纯菌种。⑵扩大繁殖：提纯的母种或从有关单位引进的母种，数量均很少，应扩大繁殖后再用。在母种繁殖时，最好一次多移些，不易多次转管，以免影响出菇率，降低产量和质量。一支斜面母种可移接40支左右斜面试管。4、质量检验对分离、引进或转管扩大的菌种，应经过质量鉴定，选优去劣，方可使用。1）检验方法①外观鉴定优良菌种：菌丝浓白、粗壮、富有弹性，则生命力强。如有子实体或茶褐色被膜，只要除去仍可使用。老化菌种：菌种已收缩、干燥或菌丝体自溶产生了大量红褐色液体，说明生活力弱，不可使用。(二)母种生产技术②显微镜检验挑取少许菌丝于载玻片上，加蒸馏水1滴，盖上盖玻片，观察菌丝形态是否为培育的菌种。③菌丝生长速度将其接种到适宜斜面培养基上，在适温下培养。凡菌丝生长较快、整齐、浓密而健壮的就是优良母种。参见p52(二)母种生产技术②显微镜检验③菌丝生长速度④出菇试验进行子实体产量和品质评比。经以上检验，通过综合评比，选出菌丝生长速度较快，子实体生长健壮、品质好、产量高的母种，即可供生产上使用。参见p52(二)母种生产技术(二)母种生产技术2）检验标准①首先要辨认分离或引进的是不是所需要的菌种；②有无杂菌污染，是否老化。(二)母种生产技术(三)原种和栽培种的生产技术原种和栽培种的生产，无论是培养基成分，配制方法和灭菌方法基本上是相同的。1）原种：是由试管斜面培养基培养的母种作种源接种而成，主要用于繁殖栽培种，也可直接用于生产。（母种→原种）2）栽培种：由原种作种源扩大而成，只能用于生产。（原种→栽培种)(三)原种和栽培种的生产技术1、常用培养料的配方和配制方法培养料木屑——米糠培养料：木生菇类，如：木耳、银耳、香菇；草茎或草粪——厩肥培养料：草生菇类，如：蘑菇、草菇；棉籽壳——米糠培养料：多种菇类。⑴粪草培养基（适用于蘑菇）稻草或麦秸20kg