噬菌体分离

变形杆菌（大肠杆菌）噬菌体生理特性研究1.变形杆菌、大肠杆菌的纯化划线分离纯化2.变形杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体分离器材：菌种：变形杆菌、大肠杆菌噬菌体样品：阴沟污水（100ml），土壤培养基：3倍牛肉膏蛋白胨培养液（4瓶，每瓶50ml），牛肉膏培养液，牛肉膏蛋白胨半固体培养基（倒上层用），牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（倒底层用）仪器：离心机，细菌滤器，抽滤装置，恒温水浴锅，无菌涂布器，无菌吸管等步骤：a.培养大肠杆菌至对数期600nm（OD值0.8左右）b.增殖噬菌体样品：取上述大肠杆菌培养液6ml于盛有50ml3倍牛肉膏蛋白胨培养液的三角瓶内，后加入污水样100ml（离心并过滤除菌），继续37℃摇床振荡培养12-14h，以增殖噬菌体。c.制备裂解液：将以上培养液3000r/min离心30min，将上清液过滤除菌，取100ml滤液及5ml大肠杆菌液加入50ml3倍牛肉膏蛋白胨培养液中，37℃培养12-18h进行噬菌体富集。d.将以上富集液3000r/min离心30min后，取上清液10mL加入5mL3×倍牛肉膏蛋白胨培养液及相应宿主菌液1mL，室温下放置1h，37℃120rpm振荡培养3.5h。e.收集噬菌体：将上述培养液于4℃下12,000g离心30min，上清液再经微孔滤膜（0.22μm）过滤，滤液即为拟含有相应宿主菌噬菌体的原液。f.验证噬菌体存在：在大肠杆菌平板上，滴加上述滤液5-7小滴,同时滴加生理盐水作为对照，进行标记，37℃培养18-20h，若出现噬菌斑，则证明滤液中存在噬菌体。3.变形杆菌噬菌体、大肠杆菌噬菌体纯化(1)用接种环取菌液一环接种于液体培养基内，再加人0.1ml大肠杆菌悬液，使混合均匀。(2）取上层琼脂培养基，溶化并冷至48℃（可预先溶化、冷却，放48℃水溶箱内备用）,加入以上噬菌体与细菌的混合液0.2ml，立即混匀，并立即倒人底层培养基上，混匀，置37℃培养12h。(3）此时长出的分离的单个噬菌斑，其形态、大小常不一致，再用接种针在单个噬菌斑中刺一下，小心采取噬菌体，接入含有大肠杆菌的液体培养基内。于37℃培养。（5）等待管内菌液完全溶解后，过滤除菌，即得到纯化的噬菌体。4.噬菌体最佳感染复数的测定培养宿主菌至对数前期，用分光光度计(BIO-RAD)测定其A600值=0.2，相当于1*108CFU/ml。按照感染复数分别为10-4、10-3、10-2、10-1、100和101的比例加入噬菌体，混匀，37℃震荡培养5h，10000g离心10min，收集上清测定噬菌体滴度。以上均作双份复管培养，取平均值，同时设空白对照，以产生最高噬菌体滴度的MOI（multiplicityofinfection）为最佳感染复数。注：感染复数：指感染时噬菌体与细菌的数量比值，即平均每个细菌感染噬菌体的数量。5.噬菌体一步生长曲线将噬菌体及宿主菌按MOI=10混合，37℃温育15min后10000g离心30s，弃上清；LB液洗涤2次，用5ml预热的LB液混悬沉淀并充分混匀，置于37℃振荡培养，并开始计时，于0时刻和每隔10min取样50微升，13000g离心30s，吸取上清测定噬菌体滴度。各时间点均做双份复管，取平均值，同时设空白对照，重复3次。最后以感染时间为横坐标，感染体系中噬菌体的滴度为纵坐标，绘制一步生长曲线，计算噬菌体的潜伏期、爆发期和爆发量。